柱前衍生-超高效液相色谱法测定母乳中16种氨基酸的含量

李 娜 ,田 芳 ,曲 栗 ,钱昌丽 ,高 琴 ,韩 丽 ,赵艳荣,王 玉∗

(1.兰州大学 公共卫生学院,兰州 730000;2.雅培营养中国研发中心,上海 200233;3.上海海关 动植物与食品检验检疫技术中心,上海 200135)

母乳作为极好的蛋白质来源,可提供婴儿所需的氨基酸,包含必需氨基酸、非必需氨基酸和其他氨基酸。必需氨基酸包括苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸及色氨酸等9种,其不能由婴儿自身合成,需要通过食物供给,具有促进婴儿组织蛋白质合成、参与其他氨基酸代谢转换、促进婴儿早期肠道成熟等重要作用[1]。非必需氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸等8种,可通过自身合成也可从其他氨基酸转化获取。除此之外,母乳中还含有胱氨酸、牛磺酸等其他氨基酸。母乳中氨基酸对婴儿早期生长发育有重要作用,准确定量分析母乳中氨基酸意义重大。

目前,氨基酸的检测方法主要有氨基酸分析法、柱前衍生-液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等[2],其中氨基酸分析法[3-8]和柱前衍生-液相色谱法[9-12]应用较多,但均不能用于检测色氨酸。氨基酸分析法的样品处理步骤简单、方法成熟,但分析时间长、仪器购买及维护成本高,相关国家标准(简称GB 法)为GB 5009.124－2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[13],该标准可检测除了色氨酸和胱氨酸以外的16种氨基酸,但蛋氨酸检测容易受到母乳基质中杂质峰的干扰[14]。柱前衍生-液相色谱法虽然样品处理复杂,但是分析快速、灵敏度高、可选衍生试剂种类多、仪器通用性强,在不具备氨基酸分析仪的条件下也可以用于氨基酸含量的测定。柱前衍生-液相色谱法应用较广泛的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)、异硫氰酸苯酯(PITC)、二硝基氟苯(DNFB)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl)、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)等。其中,OPA 衍生反应快速,但只能与一级氨基酸反应,不能直接与二级氨基酸反应;PITC毒性大,需要连接真空蒸发衍生装置;DNFB、FMOC-Cl、Dansyl-Cl的衍生副产物会干扰测定结果;AQC可以同时检测一、二级氨基酸,具有衍生时间短、衍生产物稳定、带有的6-氨基喹啉基团(AMQ)可被检测、不干扰其他氨基酸定量检测等优点[15],成为液相色谱法广泛使用的衍生试剂。文献[16]以AQC衍生,附紫外检测器的柱前衍生-超高效液相色谱法(简称AOAC 法)同时测定婴儿配方食品中除色氨酸以外的18种氨基酸(包含蛋氨酸、胱氨酸和牛磺酸)的含量。以上两种方法在母乳基质中的应用及比对分析研究较少,文献[14]进行了两种方法的比对试验,但其所使用的前处理方法与GB法的一致,且没有考虑不同泌乳阶段母乳样品中氨基酸的差异。鉴于此,本工作参考AOAC 法,并根据基质特点优化了柱温,以柱前衍生-超高效液相色谱法测定母乳中16种氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸和牛磺酸)的含量,并与GB法比对,以期为母乳中氨基酸含量的准确测定推荐适用的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity II型超高效液相色谱仪,配紫外检测器;OGS180型烘箱、G560E 型涡旋仪;FB15061型超声仪;ER-35S 型恒温加热板;5190-5269型0.2μm 尼龙针头过滤器;EFAA-DC24-RT型氮吹仪;XPE 205型电子天平;MS 304S/01型电子天平;MS 3002TS/02 型电子天平;Milli-Q Advantage A10型超纯水仪。

17 种氨基酸混合标准储备溶液:编号为AAS18,胱氨酸的质量浓度为1.25 mmol·L－1,其他16种氨基酸的质量浓度均为2.50 mmol·L－1。

牛磺酸标准储备溶液:2.5 mmol·L－1,取适量牛磺酸标准品,用水稀释并定容至100 mL 容量瓶中。

混合标准溶液系列:参考 AOAC 法,用0.1 mol·L－1盐酸溶液逐级稀释17种氨基酸混合标准储备溶液和牛磺酸标准储备溶液,配制成浓度为0.5,1,5,10,25μmol·L－1(胱氨酸浓度为0.25,0.5,2.5,5,12.5μmol·L－1)的混合标准溶液系列。

L-正缬氨酸内标溶液:10 mmol·L－1,取适量L-正缬氨酸标准品,用0.1 mol·L－1盐酸溶液稀释并定容至100 mL容量瓶中。

AQC衍生试剂:取Acc Q·Fluor衍生试剂盒中2B试剂(乙腈)1 mL,置于2A 试剂(AQC)瓶中,轻弹2A 试剂瓶中,使粉末落至瓶底,涡旋10 s后放置在55℃恒温加热板上加热10 min至完全溶解,干燥密封保存,有效期一周。

AccQ · Fluor 氨基酸衍生试剂盒套装(WAT052880),其中包含Buffer试剂(硼酸盐缓冲液)瓶、2A 试剂瓶和2B试剂瓶;L-正缬氨酸标准品纯度不小于99%;牛磺酸标准品纯度不小于99.5%;甲酸铵纯度不小于96.5%;甲酸为质谱纯;乙腈为色谱纯;苯酚、盐酸、氢氧化钠均为分析纯;试验用水为超纯水,电阻率18.2 MΩ·cm。

1.2 仪器工作条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱 温60 ℃;流 量0.4 mL·min－1;进样量1μL;检测波长260 nm;流动相A 为体积比85∶15水和浓缩液(体积比84∶11∶5 的200 mmol·L－1甲酸铵-乙腈-甲酸混合液)的混合液;流动相B 为1.3%(体积分数,下同)乙腈溶液。梯度洗脱程序:0～5.50 min时,A 为99.9%;5.50～15.22 min 时,A 由99.9%降 至90.9%;15.22～20.47 min时,A 由90.9%降 至78.8%;20.47～21.26 min时,A 由78.8%降 至40.4%;21.26～21.29 min时,A 由40.4% 降 至10.0%,保 持1.55 min;22.84～26.00 min 时,A 由10.0%升 至99.9%,保持6.00 min。

1.3 试验方法

母乳经室温解冻完全融化后,涡旋或超声至充分混匀。分取0.22 mL 至螺纹顶空瓶中,依次加入水0.88 mL、0.2 mol·L－1氢氧化钠溶液0.6 mL、0.2 mol·L－1盐酸溶液0.6 mL、L-正缬氨酸内标溶液0.2 mL、含0.1%(体积分数)苯酚的12 mol·L－1盐酸溶液2.5 mL,氮吹5 s后盖紧瓶盖,涡旋混匀,放入110 ℃烘箱中水解(24±0.5)h,取出冷却至室温。从液面下1 cm 处取0.2 mL 水解样品,加入6 mol·L－1氢氧化钠溶液0.2 mL和0.1 mol·L－1盐酸溶液0.4 mL,涡旋混匀后过0.2μm 尼龙针头过滤器。取AccQ·Fluor衍生试剂盒中Buffer试剂70μL至微量离心管中,加入上述滤液10μL,边涡旋边加AQC衍生试剂20μL,过程持续2～3 s后,迅速合上盖子,室温放置1 min,放入55 ℃烘箱,加热10 min,取出冷却后按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

柱温对基线的稳定性影响较大,因此试验比较了柱温分别为50,55,60 ℃时基线的稳定性。结果显示:柱温为50,55℃时,苯丙氨酸的色谱峰基线不平稳;升高柱温至60 ℃时,苯丙氨酸的色谱峰基线平稳。因此,试验选择的柱温为60 ℃。

在优化的试验条件下,25μmol·L－1含内标的混合标准溶液(内标物浓度为10μmol·L－1)以及样品溶液的色谱图见图1。样品溶液中天冬氨酸的浓度为天冬氨酸和天冬酰胺浓度总和,谷氨酸的浓度为谷氨酸和谷氨酰胺浓度的总和。

图1 氨基酸的色谱图Fig.1 Chromatograms of amino acids

结果显示,含内标的混合标准溶液和样品溶液中18种氨基酸可完全分离,但是在采用本方法分析实际样品中胱氨酸和蛋氨酸时,二者不能实现完全分离。试验曾尝试采用添加3,3′-二硫代二丙酸,将胱氨酸转化成S-2-羧乙基硫代半胱氨酸后再定量分析[15,17],但并不适用于本方法,具体原因还待进一步研究。

2.2 标准曲线和检出限

按照试验方法衍生和测定混合标准溶液系列,以各氨基酸的浓度为横坐标,其对应的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,17 种氨基酸标准曲线的线性范围为0.5～25μmol·L－1,胱氨酸标准曲线的线性范围为0.25～12.5μmol·L－1,其他线性参数见表1。

按照试验方法衍生并重复测定0.5μmol·L－1混合标准溶液10次,以3倍标准偏差(s)计算检出限(3s),结果见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

表1 (续)

2.3 精密度和回收试验

按照试验方法对同一母乳样品在3 d 内进行6次检测,计算测定值的相对标准偏差(RSD);对该样品进行低、中、高等3个加标水平的回收试验,计算回收率。结果显示,胱氨酸和蛋氨酸测定值的RSD 分别为15%和57%,胱氨酸回收率为79.6%,精密度和回收率均不符合方法性能要求,不推荐采用该方法检测这两种物质,其他16种氨基酸的精密度和回收试验结果见表2。

由表2可知,16种氨基酸的回收率为95.0%～108%,测定值的RSD 均不大于9.0%,表现出了良好的准确度和精密度。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.4 方法比对

选择不同泌乳阶段的母乳样品各6份,分别是1～5 d的初乳、10～15 d的过渡乳、40～400 d的成熟乳(包括40～45 d的早期成熟乳、200～240 d的中期成熟乳、300～400 d的晚期成熟乳)的母乳(以婴儿出生为起点),分别用本法和GB法检测其中的15种氨基酸,并采用SPSS 23.0软件对两种方法的测定值进行配对样本t检验,结果见表3。其中“∗”表示同一泌乳阶段两种方法的差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表3 方法比对结果Tab.3 Results of method comparison mg/100 mL

结果显示:除了成熟乳中的组氨酸外,本法测得各氨基酸的含量均高于GB 法的,大部分氨基酸的测定值具有显著性差异(P＜0.05),差异显著程度由大到小依次为初乳、过渡乳和成熟乳,说明测定值的差异和母乳样品中蛋白质的含量有关。如初乳和过渡乳中除组氨酸及精氨酸外的其他氨基酸的测定值与GB法的相对误差均大于19%,成熟乳中除组氨酸、精氨酸及赖氨酸以外的相对误差均大于11%,这与文献[14]的相对误差(小于4.7%)相差较大。推测主要原因:①本法采用的超高效液相色谱仪和氨基酸分析仪与文献[14]不同;②文献[14]中前处理方法和GB法的一致,与本法相差较大;③本法的取样量(0.22 mL)和GB法的(0.5 mL)不同,GB法取样量较大,可能出现因母乳中蛋白质水解不充分导致的氨基酸测定值偏低的现象。

为了验证本法测定值的准确度,又进行了文献对比。结果显示,本法所得成熟乳中的测定结果与文献[10]用OPA/FMOC-Cl柱前衍生-高效液相色谱法所得中国3个城市1～2月、4～8月母乳测定值基本一致,与使用AQC 柱前衍生-高效液相色谱法所得9国30～60 d母乳测定值也基本一致[9],但本法所得初乳、过渡乳中氨基酸测定值均高于同样使用AQC柱前衍生-高效液相色谱法所得中国7个城市3～6 d、10～13 d母乳中氨基酸的测定值[12],这可能与母乳的采样时间有关,因为泌乳早期母乳中氨基酸含量受哺乳时间的影响较大[9-10,18],具体原因还待进一步验证。

基于AOAC法,本工作采用AQC柱前衍生-超高效液相色谱法快速、准确测定母乳中16种氨基酸的含量,该方法具有良好的精密度和准确度,与GB法测定结果有一定差异,具体原因还待进一步验证。