固相萃取柱净化-气相色谱-三重四极杆质谱法测定茶叶中角鲨烯的含量

周 敏,孙文闪,董叶箐,赵月钧,钟寒辉,王川丕

(绿城农科检测技术有限公司,杭州 310052)

角鲨烯是动植物、微生物和海洋微藻等的脂肪组织中一种功能性活性脂质,具有抗氧化、调节胆固醇代谢、防癌抗癌、抗辐射、解毒和抑制微生物生长等功能[1-2],广泛应用于食品、医药产品和化妆品中。茶叶是人日常生活必不可少的消费品,角鲨烯是其中重要的功能成分。随着人对茶叶品质要求的提高,茶叶中角鲨烯含量的准确测定变得越来越有意义,而不同产地和不同发酵工艺制备的茶叶中角鲨烯的含量存在一定差异,因此有必要提供一种简单、通用性强的检测方法。

角鲨烯的前处理方法主要有机溶剂提取法、皂化法、分布结晶法、固相萃取法、固相微萃取法、超临界二氧化碳萃取法[3-5]。测定方法主要为高效液相色谱法[6-8]、气相色谱法[9-13]、气相色谱-质谱法[14-15]等。目前,相关研究多集中在植物油中角鲨烯含量的测定上[11-19],茶叶中角鲨烯的检测方法的研究较少。

鉴于此,本工作以固相萃取柱净化茶叶样品,以气相色谱-三重四极杆质谱法测定其中角鲨烯的含量,该方法前处理净化效果好、灵敏度高,通过内标法可以有效消除基质干扰,准确度高,可为茶叶中角鲨烯含量的测定提供重要的参考依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

TQ8040 型气相色谱-三重四极杆质谱仪;ST16R 型离心机;BSA2202S 型电子天平;TALBOYS型旋涡混合器;KQ5200E 型超声波清洗器;RE52-86A 型 旋转蒸 发仪;Reeko AutoEVA-20 型全自动氮吹浓缩仪;弗罗里硅土(Cleanert Florisil)小柱;石墨化碳黑-氨基复合(Cleanert GCB-NH2)小柱;0.22μm 有机滤膜。

单标准储备溶液:4 000 mg·L－1,分别取适量角鲨烯、角鲨烷(内标)标准品,用正己烷溶解并定容于25 mL容量瓶中,摇匀后置于4 ℃冰箱中避光保存,有效期6个月。

角鲨烯标准中间液:40.0 mg·L－1,取4 000 mg·L－1角鲨烯标准储备溶液1.00 mL,用正己烷定容于100 mL容量瓶中,摇匀备用。

角鲨烯标准溶液系列:取适量角鲨烯标准中间液和角鲨烷标准储备溶液,用正己烷逐级稀释,配制成质量浓度分别为0.030 0,0.050 0,0.200,0.500,1.00,2.00 mg·L－1的角鲨烯标准溶液系列,其中角鲨烷的质量浓度为1.00 mg·L－1,现配现用。

角鲨烯标准品(规格为5 mL)的纯度不小于99.4%;角鲨烷标准品(规格为5 mL)的纯度不小于99.5%;丙酮、正己烷、乙腈、乙醚、甲醇、甲苯、石油醚均为色谱纯;试验用水为二级水。48批茶叶样品分别为绿茶(20 批次)、红茶(10 批次)、普洱茶(10批次)和乌龙茶(8批次),产地分别为浙江杭州西湖龙井村、浙江湖州安吉县、浙江衢州开化县齐溪镇、浙江金华武义县。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);进样口温度250 ℃;载气为氦气,纯度不小于99.999%;碰撞气为氩气,纯度不小于99.999%;流量1.00 mL·min－1。柱升温程序:初始温度为80 ℃,保持2.00 min;以40 ℃·min－1速率升温至250 ℃,保持1.00 min;以20℃·min－1速率升温至290 ℃,保持3.75 min;总用时13.00 min。进样量1μL;不分流进样。

1.2.2 质谱条件

电子轰击离子源;色谱-质谱接口温度230 ℃;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;检测器电压1.40 kV;多反应监测(MRM)模式。角鲨烯、角鲨烷定量离子对质荷比(m/z)分别为136.00/112.10,113.00/71.10,碰撞能量分别为9,6 eV;定性离子对m/z分别为149.00/93.00,149.00/107.10 和113.00/57.10,127.00/71.10,碰撞能量分别为9,6 eV 和6,6 eV。

1.3 试验方法

取5.000 g样品,置于50 mL 离心管中,加入100 mg·L－1角鲨烷内标溶液50μL 和石油醚50 mL,以2 500 r·min－1转速涡旋3 min,超声30 min,以8 000 r·min－1转速离心3 min。上清液过定性滤纸,滤液置于100 mL鸡心瓶中,再按照上述步骤重复提取1次。合并提取液,于40℃水浴中旋至1～2 mL,得到待测液。用体积比3∶1 的乙腈-甲苯混合溶液5 mL活化Cleanert GCB-NH2小柱,在待测液中加入体积比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液3 mL,过Cleanert GCB-NH2小柱。分两次用6 mL体积比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液清洗鸡心瓶,洗液全部过柱,再用体积比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液25 mL洗脱小柱。洗脱液收集于100 mL鸡心瓶中,于40 ℃水浴中旋至近干,用氮气缓缓吹干后,加入5.00 mL 正己烷,超声30 s,过0.22μm 有机滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

2.1.1 提取溶剂

试验考察了乙醚、甲醇、丙酮、乙腈、石油醚等5种提取溶剂对加标茶叶样品(加标量1.00 mg·kg－1)中角鲨烯回收率的影响,每种溶剂均平行测定6次,结果见图1。

图1 不同提取溶剂效果的比较Fig.1 Comparison of effects with different extraction solvents

由图1可知:甲醇、乙腈的提取效果相对较差,回收率在60.0%,65.0%左右;乙醚、丙酮、石油醚对茶叶中角鲨烯的提取效果较好,回收率均在85.0%以上。考虑到丙酮、乙醚为易制毒有机试剂,领用成本高,试验选择石油醚作为茶叶中角鲨烯的提取溶剂。

2.1.2 提取溶剂体积

适宜体积的提取溶剂不仅能满足回收率的要求,还能避免浪费和对环境的污染,因此试验考察了提取溶剂体积(20,30,40,50,60 mL)对加标茶叶样品(加标量1.00 mg·kg－1)中角鲨烯回收率的影响,每种体积均平行测定6次,结果见图2。

图2 不同体积提取溶剂效果的比较Fig.2 Comparison of effects with different volumes of the extraction solvent

由图2可知,角鲨烯回收率随着提取溶剂体积的增加而增加,当提取溶剂体积不小于50 mL 时,回收率无明显提高,因此试验选择的提取溶剂石油醚体积为50 mL。

2.1.3 超声时间

试验考察了超声时间(10,15,20,25,30,35 min)对加标茶叶样品(加标量1.00 mg·kg－1)中角鲨烯回收率的影响,每种溶剂均平行测定6次,结果见图3。

图3 不同超声时间效果的比较Fig.3 Comparison of effects with different ultrasound time

由图3可知,角鲨烯回收率随着超声时间的延长而增加,当超声时间不小于30 min时,回收率无明显提高,因此试验选择的超声时间为30 min。

2.1.4 净化小柱

茶叶基质复杂,其中色素、茶多酚、多糖、咖啡碱、茶氨酸等成分含量较高,经过石油醚提取后,大部分有机杂质可随角鲨烯一同提取出来,如果直接上机测定,不仅会导致基线噪声高、杂质峰多,还会对仪器进样口和毛细管柱造成污染。因此,有必要对提取液进行净化。试验比较了Cleanert Florisil小柱和Cleanert GCB-NH2小柱的净化效果,样品净化前后的色谱图见图4。

图4 不同小柱净化样品前后的色谱图Fig.4 Chromatograms of samples before and after purification with different cartridges

由图4可知:未净化时,样品色谱图中杂质峰较多;以Cleanert Florisil小柱净化后,杂质峰减少,回收率为70.0%～85.0%,但样品溶液为黄色,说明该小柱对色素的去除效果较差,大批量分析时可能会污染仪器;以Cleanert GCB-NH2小柱净化后,基线噪声下降,有机干扰物减少,样品溶液为无色,回收率为77.6%～95.6%,说明该小柱对杂质的去除效果较好。因此,试验选择Cleanert GCB-NH2小柱净化茶叶样品。

2.1.5 洗脱溶剂

洗脱溶剂的选择非常重要,要求它既能洗脱目标物,又能固定杂质。Cleanert GCB-NH2小柱常采用的洗脱溶剂为乙腈-甲苯混合溶液,经过多次试验优化,发现混合溶液中乙腈和甲苯体积比为3∶1时,角鲨烯和角鲨烷均能被洗脱下来,同时色素、茶多酚、多糖、咖啡碱、茶氨酸等极性物质会固定在小柱上。因此,试验选择体积比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液作为洗脱溶剂。

2.1.6 洗脱溶剂体积

试验考察了洗脱溶剂体积(10,15,20,25,30 mL)对加标茶叶样品(加标量1.00 mg·kg－1)中角鲨烯回收率的影响,每种体积均平行测定6次,结果见图5。

图5 不同体积洗脱溶剂效果的比较Fig.5 Comparison of effects with different volumes of the elution solvent

由图5可知:角鲨烯回收率随着洗脱溶剂体积的增加而增加,当洗脱体积不小于25 mL 时,回收率没有明显提高,因此试验选择的洗脱溶剂体积为25 mL。

2.2 质谱条件的选择

对角鲨烯和角鲨烷进行一级质谱扫描,找到响应较高的离子碎片,对它进行子离子扫描,并在3～45 eV 内进行碰撞能量优化,将响应较强的3个离子对作为定量离子对和定性离子对,优化后的质谱参数详见1.2.2节。

2.3 标准曲线、检出限及测定下限

按照仪器工作条件测定角鲨烯标准溶液系列,以角鲨烯的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,角鲨烯标准曲线的线性范围为0.030 0～2.00 mg·L－1,线 性 回 归 方 程 为y＝1.725x＋0.126 0,相关系数为0.999 4。

对空白加标样品进行试验,以3,10 倍信噪比(S/N)对应的加标量计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),得到的结果分别为0.010 0,0.030 0 mg·kg－1。

2.4 精密度和回收试验

以红茶、绿茶、普洱茶、乌龙茶等经过不同发酵工艺制备的茶叶样品为待测对象,对其进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1可知,不同类型茶叶样品中角鲨烯的回收 率 为77.6%～95.6%,RSD 为4.5%～8.3%,准 确度和精密度均符合GB/T 27404－2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附表F.1和附表F.2的要求。

2.5 样品分析

按照试验方法分析各地具有代表性的48批茶叶样品,角鲨烯均有检出,检出量为0.10～29.5 mg·kg－1,但是不同茶叶中角鲨烯含量差异较大,可能与产地环境以及发酵工艺有关,需要进一步研究。

本工作以Cleanert GCB-NH2小柱净化茶叶样品,用气相色谱-三重四极杆质谱法测定样品溶液中角鲨烯的含量,该方法前处理净化效果好、灵敏度和准确度高,可为茶叶中角鲨烯的研究提供重要的参考依据。