拉曼光谱技术在肾脏病变鉴别诊断的应用进展

安蔚 梁昊岳 孔晓冬

1天津医科大学总医院保健医疗部（老年医学科），天津市老年病学研究所（天津 300052）；2中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所），实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，细胞生态海河实验室（天津 300020）

近年来肾脏疾病比例逐年升高［1］，已成为全球性重要公共卫生问题之一，一项30年（1990-2019）的调查研究显示，在全球范围内，亚洲的慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患病率最高，2019年新增CKD 病例980 万例，其中763 024 例死于CKD 及其并发症，1990-2019年间，CKD 患病率增长一倍，从2.024 亿增至4.312 亿，造成巨大经济负担［2］。早期发现及有效防治肾脏疾病对于改善患病人群后期生存质量具有重大意义。如何早期发现并及时干预保护老年人肾功能仍然是目前临床中急需解决的问题。肾脏生理结构复杂、肾脏疾病发病机制及病因多样性、早期肾脏疾病临床症状特异性差等因素导致肾脏疾病早期诊断仍然存在困难。目前肾脏疾病诊断的辅助检查主要包括血液化验、尿液化验、影像学检查以及“金标准”肾脏活检，外泌体蛋白质组学分析［3］、MRI 等对于诊断肾脏疾病的价值也在不断上升［4］。但是上述辅助检查存在价格昂贵、操作繁琐、敏感性及特异性不足等缺点，仍需探索新的诊断手段以期早期诊断肾脏疾病。

近年来，拉曼光谱技术（Raman spectroscopy，RS）在检测新的生物标记物方面颇具潜力，可协助临床筛查疾病的易感性和发病率。与传统检测方法相比，其具有非侵入性、所需样本量小、化学试剂消耗量少等优点。拉曼光谱技术目前已实现无创检测血液、尿液、脑脊液、唾液等生物标本，可用于活体内的微创、实时组织监测，辅助临床诊断神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等）［5-6］、传染性疾病（如疟疾、非洲锥虫病、新冠病毒等）［7-8］、肿瘤性疾病（如脑癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、胃肠道癌、肺癌等）［9-10］的诊断。既往有研究将RS 技术与算法模型相结合，测定肾病患者血清中尿素和肌酐的浓度、尿液中的尿素、肌酐、尿蛋白及葡萄糖含量，表明RS 技术可无创监测某些特定的肾功能指标，从而达到早期筛查肾脏疾病的目的［11］。SAATKAMP 等［12］应用RS 技术结合PLS（部分最小二乘法）模型检测尿液中尿素和肌酐的浓度，发现无肾脏疾病患者尿液样本的拉曼光谱，峰值分别为527、1 006、1 160 /cm 处（指示尿素的存在）以及681、846、908 /cm 处（指示肌酐的存在），使用该模型估计糖尿病和高血压患者的尿素和肌酐浓度发现，此类人群检测指标较健康受试者明显较低。上述研究表明RS 技术对于肾脏疾病鉴别诊断具有一定实用性及巨大潜力。因此，关于RS 技术在肾脏疾病鉴别诊断方面的探索，是本文重点阐述的内容，本文主要从急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）、慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）、继发性肾病、其他类型肾病等几方面重点论述RS 技术原理、技术优势、局限性、最新应用前景等。

1 RS 技术与AKI

1928年，C.V RAMAN 首次报道了一种分子对光的非弹性散射现象，并以他的名字将这种现象命名为“拉曼效应”，这种散射辐射称为“拉曼散射”。拉曼光谱技术，即测量拉曼散射辐射，通过使用单色光源（通常为激光）来检测从样品非弹性散射的光子，从而提供关于化学键和分子结构的信息，并且每个分子都会产生一个独特的“光谱指纹”［13］，生物分子的拉曼光谱包含丰富且复杂的信息，一般情况下需使用多元统计方法降低此类复杂数据集的维数来突出这些光谱差异，并能够提取重要生物信息，从而实现主成分分析以协助诊断和分类。利用RS 技术原理对生物标本进行分析，提取生物信息，近年来在肾脏疾病鉴别诊断领域成为热点。

KDIGO 指南对AKI 的定义［14］是出现以下情况的任意一种：48 h内血清肌酐（serum creatinine，SCr）升高≥26.5 μmol/L；或已知或认定在过去7 d 内SCr升高≥基线值的1.5 倍；或6 h 尿量＜0.5 mL/（kg·h）。临床中AKI 患者发生CKD、终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）风险性增加，因此早期诊治显得尤为重要。目前AKI 诊断标准基于SCr 和（或）尿量的改变，但由于肾损伤发生在肌酐升高之前，因此血清肌酐对于预测AKI 仍有一定限制，仍需要更加准确的生物标志物来预测AKI。既往的研究表明，术前胱抑素C［15］、术前白蛋白/肌酐比值［16］可预测围手术期AKI 的发生；尿中性粒细胞明胶酶相关脂质沉积蛋白（NGAL）、血浆NGAL 和尿白细胞介素-18（IL-18）与成人心脏手术患者AKI 的发生和不良预后相关［17］；尿中IL-18、胱抑素C、肾损伤分子1（KIM 1）和肝型脂肪酸结合蛋白的浓度也可预测内源性AKI［18］。

最新的傅里叶变换RS 技术研究发现［19］，肾缺血再灌注后伴随的生理稳态变化，可以显示出特征性的振动光谱变化。酪氨酸、色氨酸、胱氨酸/半胱氨酸、成纤维细胞生长因子、胶原蛋白Ⅲ是与振动变化相关的代谢产物，这些谱带可能成为与肾损伤患者心脏病发展相关的分子标记物，在检测与急性至慢性肾损伤进展相关的分子标记和死亡预测因子方面具有一定临床意义。相比于常规检测技术，拉曼光谱技术具有无创、标本较易获取、可实时反映机体情况等优势，对于疾病早期筛查阶段具有重大临床意义。但目前对于急性肾损伤方面的拉曼光谱临床研究仍不够完善，同时仍未确定明确的生物标志物来特定反应急性肾脏损伤，未来应继续提高拉曼光谱技术对于急性肾损伤标志物识别的敏感性及特异性，发现更多指向急性肾损伤的拉曼光谱峰位，从而更好的辅助临床诊断、筛查，更早发现肾脏损伤。

2 RS 技术与CKD

慢性肾脏疾病是世界范围内主要的非传染性疾病之一，在不同的国家，它影响着5%～13%的总人口［20］。CKD 是指肾脏损害或肾小球滤过率（GFR）下降持续3 个月及以上，并根据病因、GFR和蛋白尿标准（CGA 分类）进行分类，其中GFR 可以通过尿液和血液中过滤标记物的血浆清除率来评估，CKD 的诊断主要基于血清肌酐的测量和相应的估算的肾小球滤过率（estimated GFR，eGFR）的计算。既往的研究证明，老年人群查体时增加尿白蛋白、尿肌酐、血尿酸的定量检测，有助于肾脏损伤早期阶段CKD 的筛查［21］。CKD 可能生物标志物包括eGFR、NGAL、胱抑素C、不对称二甲基精氨酸（ADMA）、肝型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、血尿素氮（BUN）、白蛋白排泄率（AER）等，近年来有研究表明可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（suPAR）、肿瘤坏死因子受体（TNF-R）、表皮生长因子（EGF）、半乳糖凝集素3（Galectin-3）等可用作CKD 早期诊断的生物标志物［22］，但由于CKD 通常起病隐匿，早期诊断仍然存在挑战，因此需要更敏感、更简便的检测方法。

近期的研究［23］表明，RS 技术对于SCr、BUN、血清胱抑素C 的阳性检出率均明显高于常规肾功能检查，说明RS技术可用于CKD的诊断。KAMINSKA等［24］首次证实尿液细胞外囊泡（UEV）的RS 特征可作为区分健康受试者和患有不同阶段CKD 的糖尿病患者的生物标记物；ZONG 等［20］研究发现，检测CKD 组和健康对照组的血清标本时，约1 094、1 290、1 398 /cm 处的SERS 峰仅出现在CKD 患者中，而在健康对照组中未发现特别显著的峰，同时还发现CKD 患者在724、1 328、1 450 /cm 处的SERS 峰值强度高于健康对照组，而对照组在641、811、890、1 132、1 210、1 655 /cm 处的SERS 峰值强度高于CKD 患者；检测尿液标本时，健康对照组在640、724、1 137、1 343/cm 处的SERS 峰强度高于CKD 患者，而在1 079、1 185、1 287、1 383 /cm 处的SERS 峰强度增加在CKD 患者中更加明显。这些尿液光谱的标记峰位代表了其主要成分（例如尿素、肌酐、肌酸、酮体、磷酸盐、含氮化合物等），他们的研究表明血清和尿液样本的SERS 分析与PCA-LDA（主成分分析-线性判别分析）方法相结合，对于快速评估CKD 分期具有良好的潜力。熊声贺等［23］通过研究慢性肾病人群与健康人群拉曼光谱血清对比，CKD 组在544、724、933、1 004、1 368、1 442、1 607 /cm 处平均特征峰值强度均明显低于健康对照组，而在1 127、1 219 /cm 处特征峰值强度均明显高于健康对照组。

慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）是CKD持续进展后的结局，是终末期肾脏损害的一个阶段，表现为代谢产物潴留和水、电解质及酸碱失衡以及各系统症状，最终可发展为尿毒症。CHEN 等［25］的研究表明，健康对照组和CRF 患者组的拉曼光谱都存在酰胺Ⅲ（1 230～1 282/cm）、磷脂（1 447/cm）和蛋白质（1 585/cm），但在CRF 患者光谱中发现磷脂（1 447/cm）和蛋白质（1 585、1 615、1 654/cm）的拉曼峰相对强度高于正常肾功能的对照组。WANG等［26］还发现血清拉曼光谱结合分类算法可以快速准确地诊断和区分甲状腺异常患者、慢性肾功能衰竭患者和健康个体：慢性肾功能衰竭患者的类胡萝卜素水平（1 006、1 157、1 515 /cm）高于甲状腺功能异常患者和健康个体。此外，GAO 等［27］将血清拉曼光谱和卷积神经网络（CNN）相结合，发现CRF 患者和正常人的血液拉曼光谱在1 003/cm等处均有高强度峰值，但正常人的峰值强度明显高于CRF患者；CRF患者光谱在957、1 193、1 210/cm处的峰值强度均不同程度低于正常人，而在1 445、1 655/cm处的峰值强度略高于正常人。BRATCHENKO 等［28］通过拉曼光谱技术结合PLS-DA（偏最小二乘法）模型，表明利用拉曼光谱进行皮肤分析可能用于识别肾衰竭。上述研究成果说明血清拉曼光谱技术可能成为临床辅助诊断CRF 工具，从而早期发现CRF。

上述研究结果表明，CKD、CRF 患者与健康人之间的血液、尿液等生物标本通过RS 技术分析后可呈现特定差异，为早期发现肾脏病变提供了新的技术手段，与临床上常用的传统辅助化验检查及有创操作相比，其表现出更高的准确性、所需样本量少、重复操作性高等优势，不足之处在于关于慢性肾脏病的相关研究数据尚不完善，尚未建立系统的RS 技术筛查体系，未来应继续完善RS 技术在相关方面的研究，利用RS 技术优势，实现更加快速、高效地评估患者肾功能，发展为非侵入性辅助诊断、快速筛查的技术手段。

3 RS技术与继发性肾病（secondary nephrosis）

继发性肾病指肾外疾病，特别是全身性、系统性疾病导致的肾损害。虽然全身性疾病引发的肾损害有一定的交叉，但仍然可以根据全身性疾病进行分类。全身性疾病见于糖尿病、高血压、自身免疫性疾病、淀粉样变、肿瘤、感染及某些遗传性疾病等。在我国，糖尿病肾病及高血压肾病是终末期肾病的主要病因［29］。

3.1 糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）DN 是终末期肾病最常见的病因［30］，其基本病理特征是肾小管间质病变、肾小球基底膜增厚、系膜基质积聚和结节性肾小球硬化［31］，主要临床表现为不同程度蛋白尿及肾功能的进行性减退，DN 的诊断标准包括肾功能下降、糖尿病视网膜病变、尿白蛋白与肌酐比值升高以及肾小球滤过率降低［32］。随着糖尿病发病率的上升，DN 已成为中国CKD 的第一大病因［33］，其中大多数DN 由2 型糖尿病发展而来。但DN 的预防和治疗仍然面临着挑战，其中一个困难就是疾病初期，在蛋白尿出现之前已发生早期肾损害［34］，而无任何临床表现。如何在无症状阶段发现早期糖尿病肾脏损害，是临床中需要解决的问题。FLORES-GUERRERO 等［35］通过拉曼光谱检测2 型糖尿病患者尿液标本，发现尿液中的肌酐、尿素、水和白蛋白等物质在拉曼光谱中有其对应的拉曼峰，其中1 450 /cm 处的拉曼信号强度增加，对应于尿白蛋白浓度的升高，此方法可发现糖尿病患者低浓度的尿蛋白排泄增多，可应用于筛查早期糖尿病肾病；HUANG 等［11］首次将SERS 与PDA 芯片相结合，用于检测尿液中的微量白蛋白，以上研究表明拉曼光谱技术应用于筛查糖尿病肾病的可行性。

3.2 高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）相关肾病 高尿酸血症相关肾病在临床上分为急性和慢性高尿酸性肾病及尿酸性肾结石。急性尿酸性肾病一般都有明确的诱因，可表现为少尿性肾功能衰竭。尿酸是嘌呤在肝脏内进行一系列代谢后的终产物，一般是由细胞代谢分解的核酸、嘌呤类化合物及食物中的嘌呤产生，最后经肾脏排出体外。慢性肾脏病中合并无症状HUA 的发生率逐年升高［36］，高尿酸血症可继发于肾脏疾病，并可进一步加重肾脏疾病的发展，可导致高尿酸肾损害（包括急性和慢性高尿酸血症性肾病及尿酸性肾结石）［37］，因此早期发现高尿酸血症可减轻高尿酸肾损害。高尿酸血症是指人体内嘌呤代谢异常而引起血尿酸升高的一种代谢综合征。根据《中国高尿酸血症及痛风诊疗指南（2019）》［38］，高尿酸血症诊断标准为：无论男女性别，非同日2 次测量血尿酸水平超过420 μmol/L。目前临床上常用的尿酸检测方法为磷钨酸还原法和尿酸酶—过氧化物酶偶联法等，但是上述方法存在操作繁琐等诸多不足，因此需要更加简便的方法测定尿酸水平。有研究表明［39］，通过利用高效液相色谱法、吸光度下降法、毛细管电泳法及流动注射化学发光法等尝试检测尿液中尿酸含量后，发现上述方法具有前处理步骤复杂、仪器设备要求高、成本高等缺点，因而不适用于临床。还发现将150 nm 的金纳米粒子作为基底，利用表面增强拉曼光谱技术在0.01～0.5 mmol/L 范围内对尿液中的尿酸含量进行定量分析，可以高效、便捷地测定尿液中尿酸。此外，已有大量研究应用拉曼光谱技术监测尿酸水平，并取得了一定进展。HERNANDEZ 等［40］通过将电化学表面氧化增强拉曼散射（EC-SOERS）与平行因子分析（PARAFAC）模型的相结合，实现了在相关复杂样品中测定尿酸；WANG 等［41］研究发现采用银碳点纳米复合材料作为SERS 基底时，在1 605/cm 处可以检测到oxTMB（氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，UA 还原后的产物）的SERS 信号，从而实现检测尿酸的目的；ALULA 等［42］首次采用ZnO/Fe3O4制备SERS 衬底，这种材料稳定且灵敏，可应用于测定尿液中的尿酸，且无需对尿标本进行预处理，从而简化了尿酸测定过程。上述研究证实拉曼光谱技术可用于尿酸的快速检测，为快速、简便检测尿酸提供了可能。

3.3 ANCA 相关性肾小球肾炎（ANCA-associated glomerulonephritis，AAGN） 抗中性粒细胞胞浆自身抗体（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相关血管炎是一种自身免疫疾病，可累及全身多个脏器，当累及肾脏时可出现蛋白尿、血尿、高血压等临床症状，肾活检是诊断血管炎肾病的“金标准”，但由于病程的反复性，需要更为简便、安全的辅助检查手段进行复查或早期筛查。MORRIS等［43］利用拉曼光谱技术对AAGN 患者尿液标本进行光谱数据分析，发现光谱数据能够高度准确地区分慢性损伤和活动性疾病的组织学病变，从而确定疾病是否处于活动期，为AAGN 的诊断与筛查提供了新的方向。

综上，拉曼光谱技术在几种常见的继发性肾病方面已有一定探索，并表现出无创、简便等优势，同时可以减少实验室一次性耗材的使用，是更可持续发展的技术手段。不足之处在于，目前RS 技术尚不能同时检测尿液中的多种蛋白质，而且由于设备昂贵等问题，难以大规模投入临床。同时，目前未检索到关于RS 技术在高血压肾病方面的探索，未来应继续探索RS 检测技术在血管相关性肾病方面的研究，如肾动脉狭窄相关肾病等，完善检测尿液中的多种蛋白质的方法，进一步降低技术操作成本，使RS 技术在临床推广成为可能。

4 RS 技术与其他类型肾病

肾脏疾病包含种类众多，除上述已经提到的研究进展外，拉曼光谱技术在其他肾脏疾病方面也有所发展。研究表明，RS 技术结合多变量分析可用于诊断急性肾炎小鼠［44］；MULLER-DEILE 等［45］发现，RS 能够在血清和组织水平上分析出复发性特发性局灶节段性肾小球硬化（FSGS）的“分子指纹”，并揭示与患者血清质谱相对应的代谢组学变化，他们发现FSGS 组与健康对照组的拉曼峰在对应于膜结合磷脂酰胆碱、苯丙氨酸、磷脂、脂肪酸和鞘磷脂的波长处存在最显著差异，RS 不仅可以检测到血清的血脂异常，还可以检测到组织水平上的脂质谱变化；HE 等［46］建立了基于光学拉曼光谱的支持向量机（SVM）模型来完成肾细胞癌的诊断，此外一篇Meta 分析表明［47］，RS 对肾癌的总体诊断敏感性为0.96，特异性为0.91。

综上，既往研究证明RS 技术应用于诊断肾病方面的潜力，与传统技术手段相比，RS 数据提供了丰富的信息，且能一定程度上定量反映物质浓度，但由于RS 机器操作较为复杂且检测时间较长，因而对操作人员有较高技术要求，同时光谱数据信息量大，需结合算法分析模型简化数据，这就使检验过程变得较为复杂，未来研究可简化操作步骤，提高操作易行性，简化算法模型，从而使拉曼光谱技术更加广泛应用于临床。

5 结论与展望

拉曼光谱技术在肾脏疾病鉴别诊断中已取得一定进展，表现出非侵入性、所需样本量少、重复操作性高等优点，但目前拉曼光谱技术在大多数肾脏疾病诊断方面仍处于探索阶段，多局限于实验室研究阶段，相关研究数据尚不完善，尚未建立系统的拉曼光谱技术筛查体系，同时仍存在设备要求严格、成本高等问题，应继续完善拉曼光谱技术在肾脏疾病方面的研究，完善疾病相关光谱峰位等信息，进一步辅助临床诊断。

本课题组在共聚焦拉曼光谱技术用于血液系统疾病以及神经退行性疾病的鉴别诊断方面已进行了一定探索［48-51］。近期本课题组研究发现，拉曼光谱技术结合OPLS-DA 模型（正交偏最小二乘判别分析），可实现利用骨髓上清液标本检测不同类型的急性白血病（acute leukemia，AL），并可将AL 患者的生化参数与AL 的分类及预后联系起来，具有简便、无创且具有高灵敏度和特异性等优势［52］。目前本课题组正在研究利用拉曼光谱技术检测尿液标本，结合尿微量白蛋白肌酐比值等生化指标，以期快速、简便发现早期肾脏病变。未来将继续完善RS 技术，增加标本检测速度，简化设备，发展居家便携式仪器以监测特定指标，同时不断提高其诊断疾病的准确性、敏感性、特异性，降低其应用成本，使之成为更好的辅助检查工具。不断发展RS 技术与临床相结合，发掘拉曼光谱技术在肾脏疾病鉴别诊断的潜能，对于早期诊断肾脏疾病、改善肾脏患者预后，进而减轻后期疾病的经济负担具有重大意义。