乳源性外泌体减少新生儿肠道损伤

李鸿鸣，廖海蓉

（岳阳市妇幼保健院新生儿科，湖南 岳阳 414000）

1 概述

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿最具破坏性的肠道疾病，是导致新生儿死亡的重要原因，不同的研究中NEC的发病率不同，最新研究显示，极低出生体质量儿（very low birth weight，VLBW），NEC 的发病率为 16.7%～20.7%，严重NEC病死率可高达50%，是新生儿紧急肠道手术的主要原因，且幸存者也常伴有短肠综合征、神经系统发育异常等多种并发症，严重影响新生儿生存质量[1-4]。虽然目前NEC 的发病机制尚未明确，但国内外研究表明主要有以下方面的原因：肠道免疫系统发育不成熟、肠道微生物失衡、肠道缺血缺氧及不合理肠内喂养[3，5-7]。

母乳是公认的生命早期的最佳营养来源，其中的营养素含量会随着成长中婴儿的需求而变化，保障儿童时期免受传染性及炎性疾病的侵害[8-12]。母乳中含有很多生物活性因子，如独特的微生物组、寡糖、低聚糖、免疫球蛋白（SIgA）、乳铁蛋白、生长因子（IL-6，IL-10）等，这些生物活性成分能调节免疫系统发育，减轻炎症反应，尤其是在早产儿肠道生物学中具有至关重要的作用，但其对NEC的保护机制目前尚未明确[13-18]。有研究指出，其主要的潜在保护机制之一可能与母乳中存在大量的外泌体有关。国外研究者已发现外泌体在细胞间通讯、防御病毒等方面具有关键作用，且最近的研究结果发现，母乳来源的外泌体可支持新生儿胃肠道及免疫系统的发育[19-23]。

2 外泌体

1983 年 ，Harding 和 Pan and Johnstone 报 道 指出，转铁蛋白受体通过大小为50 nm 的小囊泡在血液中运输，而在当时，对细胞之间传递信息的机制尚未了解，直到4 年后，Rose Johnstone 将这类在细胞间起到信号传导作用的囊泡定义为外泌体。2013 年，有学者揭示了外泌体转运的机制，并触发了外泌体作为疾病诊断和治疗的生物标志物的潜在用途[24]。此后，外泌体的生物学功能逐渐引起各个领域学者的关注。

外泌体是从细胞质膜释放的内吞囊泡，直径为30～200 nm，包含有多种生物活性因子，存在于唾液、尿液、血液、母乳等众多体液中[25]。这些膜囊泡由细胞主动分泌，细胞通过膜囊泡在细胞内、细胞器 之 间 传 递 microRNA（miRNA），信 使 RNA（mRNA），蛋白质和其他蛋白，膜囊泡包含受体以确保运输特异性[26]。几乎所有哺乳动物细胞类型均释放外泌体，且外泌体是起源细胞所特有的，具有其来源的患病细胞的生物标志性特质，因此，应用于诊断治疗学具有重要作用[24]。外泌体可通过调节AKT/ERK增殖转录途径增加包括软骨和内皮细胞在内的不同细胞类型的增殖和存活率，同时，还能调节NF-kB炎症信号转导途径及T细胞启动和激活的能力[27-31]。外泌体细胞来源不同，功能各不相同。如来自免疫细胞的外泌体可以参与免疫系统调节；来源于干细胞的外泌体，能降低大鼠严重坏死性小肠结肠炎的发生率，还可以增加小鼠心脏的收缩力并降低其舒张压，加速小鼠骨折愈合，促进神经生长等，表明外泌体有益于健康[29，32-34]。不同细胞来源的外泌体跨细胞交流功能也较广泛，受体细胞类型较多，为外泌体发挥各种生物调节功能奠定基础。关于外泌体在NEC中的作用已有部分研究，在体外和体内已发现源自骨髓间充质干细胞的外泌体可以容纳受损的肠段并保护肠道免受NEC感染[35]，然而关于母乳来源的外泌体对NEC的影响尚不清楚。

3 乳源性外泌体

近年来，人类母乳中检测到的免疫学成分列表显著增加，母乳中富含大量的分泌性免疫球蛋白（尤其是IgA）、抗微生物因子（如溶菌酶、乳铁蛋白和寡糖）等，这些与免疫相关的因素不仅可以为婴儿提供被动免疫，还可以促进和调节婴儿自身免疫系统的发育[13-18]。外泌体是存在于各种体液中的小的内吞性囊泡小体，在母乳中含量尤其高。乳汁来源的外泌体包裹了各种类型的生物活性因子，如蛋白质、mRNA 和miRNA，并保护他们免于酶促和非酶促降解，这种稳定性可使外泌体内容物完好无损地到达新生儿的肠腔并被吸收，从而发挥其作用[36]。Alison 等[37]收集产后 7～14 d 大鼠乳汁 ，通过试剂盒提取外泌体，将提纯后外泌体0.5 μg/μl 处理IEC18细胞5 h后，外泌体组IEC18细胞活性较无外泌体组明显提高[（0.24±0.01）vs.（0.18±0.01），P＜0.05]，且研究结果显示经外泌体处理后，IEC18细胞的肠道干细胞标志物G蛋白偶联受体5（Lgr5）基因表达水平增加[（6.96±2.66）vs.（1.00±0.59），P＜0.05]，该研究结果表明，外泌体可以显著促进肠上皮细胞的活力，增强肠上皮细胞增殖能力，并可刺激肠干细胞的活性。研究发现，无论是大鼠乳汁中的外泌体还是牛乳来源的外泌体均可以促进肠上皮细胞增生，并刺激肠道干细胞活性，这也就可以解释为什么母乳喂养可以有助于预防NEC 的发生[37-38]。Colin Martin 等对母乳外泌体进行纯化分析，纯化的外泌体的大小＜200 nm，平均大小（74.6±48.0）nm。使用不同浓度外泌体培养IECs细胞，当浓度达到10 μg 时，对细胞活性有直接影响，用H2O2处理IEC-6 细胞导致细胞缺氧损伤后，分别使用外泌体1、10 μg 处理的细胞细胞，细胞损伤被修复，与对照组（不含外泌体的细胞死亡率达到50%）比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），该研究结果显示，人类母乳来源的外泌体可以减少肠道细胞的氧化应激相关的损伤[24]。病原菌的入侵和未成熟的肠道屏障是导致NEC 发病机制的关键因素，杯状细胞负责黏蛋白及糖蛋白的产生，而黏蛋白及糖蛋白是防止细菌渗透的黏液性屏障，近年来，几项研究已经确定了杯状细胞为实验性NEC中恢复肠屏障的有效治疗靶点，而Bo 等[38]研究结果显示，乳汁来源的外泌体增加了体内杯状细胞的表达，在NEC 小鼠模型中，给予牛乳来源的外泌体后，杯状细胞的数量增加，可防止NEC 引起的肠道损伤[39-43]。

综上所述，乳源性外泌体参与代谢过程、发育过程、免疫系统过程，与生物粘附和细胞增殖有关，可以促进肠道上皮细胞的活力，增强其增殖能力，并刺激肠道干细胞的活性，具有广阔的应用价值，补充外源性外泌体可以为有发生疾病风险的婴儿提供一种有效的预防方法，尤其在无法母乳喂养的情况下，可有效预防NEC 的发生，减少新生儿的发病率、病死率及致残率，为新生儿提供更好的营养。