基于环介导等温扩增的微流控技术在病原体检测中的发展与应用

欧红玲，王绮远，王岩，张巧云，马盈盈，白静，康少平，王欣茹

(1.火箭军特色医学中心检验科，北京 100088； 2.河北北方学院医学检验学院，河北 张家口 075000)

传统的微生物培养法是病原体检测的金标准，需要耗时3～5 d，涉及多种仪器和试剂，对人员的专业技能和经验要求高。因此，缩短检验时间和减少实验条件限制一直备受关注。近年来，利用分子生物学方法快速检测病原体的技术取得了很大进展[1-4]，但检测仪器(核酸扩增仪)昂贵，且对实验室和人员的要求较高，操作程序复杂，检测需要3～5 h，主要适用于大型医疗机构和专业实验室。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术通过独特的引物设计和链置换酶，可在恒温条件下自动循环合成目标基因，这种技术摆脱了对热循环聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪的依赖，降低了核酸检测的复杂度，1 h内即可得到实验结果。微型铸造加工技术的发展促进了早期微流体的研究[5]，实现了微米空间通过流体对研究对象的分析。随着加工技术的发展，微通道的设计可将微流体分隔成多个反应单元，用于多种病原体检测[6]，可以保证各自反应的独立性和结果的准确性。基于LAMP的微流体检测技术发挥LAMP和微流控的优势，检测体系仅需要少量的样本和试剂，操作程序简单，不需要大型的昂贵仪器设备和专业技术人员，利用相机等成像设备或肉眼等即可观察结果。目前，LAMP技术主要应用于食品安全和医疗检测领域，在环境污染检测[7]、刑事侦查[8]和检验检疫[9]等方面广泛应用。现对基于LAMP的微流控技术在病原体检测中的发展与应用进行综述。

1 基于LAMP的微流控技术

Notomi等[10]提出了一种新型等温扩增方法，LAMP针对靶基因的6个区域设计4～6条特异引物，在恒定温度下，利用链置换DNA聚合酶快速扩增目标基因的DNA或RNA，通过观察添加的指示物颜色变化或产生的荧光信号强度达到检测的目的。检测过程不需要昂贵高精密的仪器，只需要一个恒温箱就能实现目的基因的大量、高效扩增，与PCR技术相比，LAMP技术运行成本低、检测时间短，且LAMP对目的基因有高度选择性，能降低非靶序列的影响，具有较高特异性。微流控技术与LAMP结合提高了病原体检测的效率，实现了快速、廉价、便捷的诊断分析[11-12]，芯片的密闭空间避免了LAMP潜在的气溶胶污染[13]。

1.1基质材料的发展 微流控技术发展以来，科研人员一直致力于寻找合适的基质材料作为实验进行的载体。玻璃类[14]、石墨烯[15]、聚二甲基硅氧烷[16]、聚甲基丙烯酸甲酯[17]等材料不断被研究并用于制作微流控设备。早期微流体分析设备主要以玻璃、硅、石英或塑料等为基质材料，因成本高、制作方法比较复杂、重复使用易污染等限制了其大规模使用。2007年，纸质材料被应用到微流控技术中制作成纸质芯片[18]，由纯纤维素制成的层析纸和滤纸，通过毛细管作用驱动液体，结合聚二甲基硅氧烷或石蜡等疏水材料，根据实验需求设计制作成2D或3D微流控设备，完成病原体检测。Cheng等[19]使用纸基微流控芯片检测人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)和T7噬菌体，结果表明，纸基微流控芯片法较酶联免疫吸附法和PCR法检测快速且更经济。王欢[20]将纸质微流体与LAMP结合构建可视化的病原体和耐药基因检测芯片。李尚阳等[21]将LAMP联合横向流动试纸条可视化检测志贺氏菌。Meng等[22]通过基于聚二甲基硅氧烷材质的微流控芯片技术实现鉴别金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌的多重实时检测，以mecA和femA基因为靶点预测对甲氧西林耐药性，实验结果与常规实验一致。材料技术和工艺的不断完善提高了LAMP与微流控技术在病原体检测领域的效率，多项研究满足多样本、多菌种同步定性检测及鉴定需求，显示了强大的应用潜力。

1.2结果监测的发展 凝胶电泳法作为观察LAMP结果的“金标准”[10,23]，能形成具有代表性的瀑布状图形，但无法在微型的微流控设备上实现，易造成实验室污染，故多不采用凝胶电泳法对基于LAMP的微流控检测结果进行判读。目前，LAMP的结果观察常用比色法，其操作简单、对阅读器要求较低，有时肉眼即可观察结果。对于产生大量焦磷酸镁白色沉淀的LAMP检测阳性反应，可利用浊度仪对结果进行实时、定量检测[24]，也可用肉眼进行结果判读，但肉眼观察结果时可因观察者的主观判断差异产生误差，特别是弱阳性结果，故可在此基础上通过添加染料(羟基萘酚蓝或钙绿黄素等)使结果易于肉眼观察，羟基萘酚蓝不会抑制LAMP反应过程，故被广泛使用[25]。

针对病原体检测的最好方法是荧光信号检测，荧光团极敏感，若以纸材料为基质制作微流控芯片，纸的美白剂会增加背景光，影响荧光信号的检测，所以荧光检测依赖于高质量的信号阅读装置，一般情况下基于荧光实时检测的LAMP反应较浊度实时检测的LAMP反应更快，且灵敏度更高，反应中不透明混合物(蛋白质和质粒)对实验结果的影响更小，但检测成本更高。

2 基于LAMP的微流控技术在病原体检测方面的应用

病原体的快速准确检测对流行病学分析和感染性疾病早期防控具有重要意义。基于LAMP的微流控技术为病原体即时检验提供了一种快速诊断方法，尤其适合于基层实验室、灾区救治、感染事件现场等极端条件下病原体的快速筛查和现场检测。

2.1在呼吸道病原体监测中的应用 呼吸道病原体感染是呼吸系统的常见病，季节交替时更易发生，特别是流行性感冒病毒的易感人群，可能引起流行性感冒的爆发，基于LAMP的微流控技术特别适合于临床病原体的快速诊断。赵溜[26]对呼吸道感染痰标本分别进行普通痰培养和常见呼吸道病原体的扩增分析(利用晶芯等温扩增技术)，结果显示，晶芯呼吸道病原体检测较传统痰培养的阳性率高，肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜肺军团菌和结核分枝杆菌复合群的病原体检出结果一致，但肺炎链球菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的检出率明显高于传统痰培养，有助于减少漏检，对疾病进行更早的诊断和治疗。李艳燕等[27]收集患者深部痰液标本进行呼吸道病原体检测，LAMP微流控芯片的呼吸道病原体检出总阳性率为58.27%(155/266)；而传统分离培养法的呼吸道病原体检出阳性率为35.8%(92/257)。可见，与传统分离培养法相比，LAMP微流控芯片的呼吸道病原体检出率高，检测快速、高效且灵敏度高，可为临床快速诊断和精准治疗提供可靠依据。此外，LAMP微流控芯片检测可一次快速检出多种病原体，较传统痰培养更具优势，可更早地发现病原体感染，以早期抗感染治疗，提高治疗效果。

2.2在HIV检测中的应用 目前，尚无治疗HIV感染所致获得性免疫缺陷综合征的有效手段，仅可通过药物缓解发病或控制症状，故HIV感染的早期诊断有助于患者早期治疗。Damhorst等[28]使用微流控和硅芯片平台对最小处理的HIV加标全血样本进行逆转录LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)，并使用普通智能手机进行荧光测量，结果显示，在～60 nl RT-LAMP液滴中，只有3种病毒扩增，相当于每微升全血中670种病毒的全血浓度，表明可通过手指穿刺血液确定HIV阳性个体的病毒载量。郭宏雄等[29]成功建立了LAMP检测HIV-1 DNA的方法，该技术的灵敏度高达10拷贝/μl，检出率高达84.3%，可检测国内4种主要亚型CRF0AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B亚型HIV-1重组型，且特异性良好。Chen等[30]将LAMP和微流控芯片技术结合，成功实现了HIV RNA的卡式芯片提取和RT-LAMP检测，大约20 min即可完成检测，灵敏度较高，表明卡式RT-LAMP技术可成功实现HIV检测，且该研究建立的微流控系统能够检测血液或唾液样本中的宿主抗HIV抗体和病毒RNA，结果较免疫方法和分子方法更可靠。综上，基于LAMP和微流控技术的优势建立的检测方法程序简单，可实现标准化，适用于HIV感染的早期快速检测及极端条件下的病原体早期筛查。

2.3在结核分枝杆菌检测中的应用 结核病亦称“痨病”，是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。近年来，受到流动人口增加、耐药结核分枝杆菌蔓延、结核分枝杆菌与HIV双重感染等客观原因的影响，结核病的发病率和病死率升高。方雪恩[31]结合微流控芯片技术和LAMP建立了单个和多重定性定量的微流控集成芯片，整合基因的提取、扩增以及信号检测，仅需要微量的原始样品，即可在45～60 min内直接通过裸眼判定结核分枝杆菌。朱亚光等[32]采用LAMP芯片法和罗氏培养法对疑似关节结核患者的关节液或感染创口分泌混合液进行鉴定，结果显示，LAMP芯片法的检测阳性率明显高于罗氏培养法，表明恒温扩增微流控芯片检测可作为关节结核的筛查实验。2016年，世界卫生组织推荐LAMP法作为结核分枝杆菌DNA检测项目，用于肺结核的诊断和鉴别诊断。因此，基于LAMP的结核检测体系具有良好的引物设计和质量控制体系，可弥补痰涂片的不足，并扩展到其他病原体的快速床边检测，对急性传染病的防控具有重要意义。

2.4在脑膜炎奈瑟菌检测中的应用 脑膜炎奈瑟菌通过呼吸道传播，是引发流行性脑膜炎的唯一病原菌。预防脑膜炎奈瑟菌感染的关键是尽早清除传染源、早期诊断和治疗，切断传播途径。Dou等[33]自主研发的基于LAMP的聚二甲基硅氧烷/纸混合微流控芯片可实现对脑膜炎奈瑟菌的检测，最低检出限仅为3拷贝/LAMP反应区，灵敏度高。李海清等[34]针对脑膜炎奈瑟菌属基因序列设计引物建立了基于LAMP的脑膜炎奈瑟菌快速检测方法，并通过优化检测系统，使其反应更加快速，其灵敏度为普通PCR法的10倍，适用于普通实验室及即时检验，有助于提高检测速度、缩短检测时间、摆脱实验设备和技术人员等条件的限制，为感染性疾病的早期诊断和治疗提供有效可行的方法。

2.5在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)检测中的应用 HBV感染是人类健康的世界性公共卫生问题之一。在HBV诊疗过程中，尽早发现早期低病毒血症患者、将诊疗关口前移、及时干预，是目前临床关注的问题。王可可等[35]利用基于PCR的微流控芯片成功完成了HBV核酸的快速检测，Ct值约为37时，检测结果为弱阳性，血液样本检出微量HBV，可早期发现HBV感染。郅晓[36]将设计制作的LAMP微流控集成芯片在恒温63 ℃反应1 h后，成功完成HBV的基因分型检测，该微流控芯片通道内反应发生时，微流控芯片标记探针的同一区域在注入磁性纳米团簇前后发生磁场变化，被巨磁阻传感器检出，电阻变化显示阴、阳信号变化，上述检测体系集样品的混合、核酸扩增以及信号采集等功能于一体，对电信号的检测更灵敏，检测范围为10～109拷贝/ml，具有耗时短、特异性好、灵敏度高、抗干扰能力强等优点。高敏感的基于LAMP的HBV微流控检测芯片的应用，可尽早发现低病毒血症及隐匿性肝炎患者，降低漏检的可能性，阻断HBV感染的传播。

2.6在新型冠状病毒检测中的应用 新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)的高效、准确、快速实验室检测是阻止疫情发展、确保患者尽早治疗的关键环节。2020年11月17日，美国食品药品管理局紧急发布使用授权，批准Lucira COVID-19一体化测试盒作为“新型冠状病毒居家自检测试剂盒”，该试剂盒利用RT-LAMP技术检测SARS-CoV-2的N基因RNA，通过微流控装置中光学和电子元件实时检测反应混合物的颜色变化，30 min内实现新型冠状病毒的快速诊断；采用罗氏COBA S-CoV-2试验对101名怀疑有症状受试者的鼻拭子样本进行差异分析，Lucira COVID-19一体化测试试剂盒与美国食品药品管理局授权的高灵敏度分子SARS-CoV-2分析的阳性符合率为94.1%(48/51)，阴性符合率为98%(49/50)，体现了Lucira COVID-19一体化测试试剂盒的良好检测性能[37]。NSF International和Novateur Ventures的研究人员在筛选了1 100多个独立评估COVID-19的即时检测测试后，推荐基于RT-LAMP原理的Seasun Biomaterials AQ-TOP Plus COVID-19 Rapid Test用于新型冠状病毒急性感染的病毒RNA检测[38]。Augustine等[39]通过分析发现，PCR的局限性包括实验室、技术人员和从业法规制度的要求较高，以及结果等待时间较长、测试总费用高昂。这促使研究人员寻找快速、经济且可执行的替代诊断方法。基于RT-LAMP检测体系集成微流控载体为快速经济高效诊断COVID-19提供可靠解决方案，特别是为发展中国家和低收入国家准确检测低拷贝数核酸提供了可靠的替代平台。值得注意的是，以纸条形式开发的基于RT-LAMP的诊断工具或将该方法集成到微流控平台(如芯片实验室)彻底改变了COVID-19诊断中即时检验的概念，体现了COVID-19诊断背景下RT-LAMP的应用前景。

3 小 结

微流控技术与LAMP的整合具有集成化和微型化的优势，通过结合两种技术建立快速检测方法是当前的研究热点，且其在病原体快速检测方面的广泛应用是未来的发展趋势。微流控装置制作工艺的日益成熟、反应系统性能的提高、人工操作的减少、自动化程度的提高均有助于提高检测速度和通量，并实现检测标准化。基于LAMP微流控芯片的检测速度快、灵敏度高、特异性强，适用于即时检验[40]，特别适用于不具备病原体培养条件、缺乏病原体检测设备及专业人员等情况下的病原体快速检测，如现场野外、灾区救治、基层医疗机构，既可降低成本，又可实现高质量的快速诊断，在病原体感染所致重大疾病的防控及公共卫生事件的处置中均有非常重要的现实意义。然而，目前建立的微流控反应体系在兼容样本的核酸提取和多重扩增条件的一体化方面尚存在不足，随着技术持续改进优化，基于LAMP的微流控技术将日益完善，未来有更加广阔的应用前景。