粪便标志物在新生儿坏死性小肠结肠炎早期诊断中的研究进展

宋淑婷，戴立英

(安徽医科大学附属省儿童医院新生儿科，合肥 230000)

新生儿坏死性小肠结肠炎(neonatal necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿重症监护室常见的严重胃肠道急症。我国一项多中心研究流行病学资料表明NEC发生率与体重呈负相关，在低出生体重儿(<2 500 g)中发病率约为 2.50%，在极低出生体重儿(<1 500 g)中发病率约为 4.53%[1]。目前NEC病死率仍高达20%～30%，并且存活的婴儿可能存在长期并发症，如肠道狭窄或粘连、胆汁淤积、短肠综合征和神经发育迟缓等[2-3]，如果能早期甄别并及时治疗，可降低病死率及预后不良发生率。目前主要依靠临床表现、腹部X线以及血清指标诊断，血液中降钙素原、白细胞介素(interleukin，IL)-6、C反应蛋白及半乳凝集素4等升高对预测NEC具有一定价值[4-5]，但需要采集患儿血液，为有创伤性操作，且主要反映全身炎症情况，不能准确提示肠道炎症程度，特异性差。腹部X线提示门静脉积气或肠壁积气时疾病往往已处于严重阶段，不利于早期诊断和治疗。所以亟须找到无创、简单、高敏感性和特异性的NEC标志物。近年来发现某些粪便标志物[如钙卫蛋白、肠道菌群谱、自诱导分子2(autoinducer-2,AI-2)]在NEC发生发展中有一定的变化规律，提示可能成为早期诊断NEC的有效生物学指标[6-8]。现就粪便标志物在NEC早期诊断中的研究进展进行综述。

1 钙卫蛋白

1.1钙卫蛋白的生物学效应 S100蛋白家族是分子量约为36 000的钙和锌结合蛋白，由S100A8和S100A9组成二聚体，主要源于中性粒细胞，也在巨噬细胞和单核细胞表达[9]。当肠道出现炎症时，钙卫蛋白在单核细胞、促炎因子及内皮细胞的作用下被激活释放，可作为急性炎症细胞的活化产物。而且钙卫蛋白可与钙、锌等结合，不仅维持自身性质的稳定，防止被肠道蛋白酶水解，还能减少细菌生长所需的原料，具有一定抗菌作用。钙卫蛋白存在于各种体液，在粪便中的浓度约为血液的6倍[10-11]。

1.2钙卫蛋白变化与NEC的关系 目前钙卫蛋白已用作炎性肠病诊断及疾病活动度的检查方法之一，但尚未作为一种特异性标志物用于临床NEC的诊断。有研究表明，NEC患儿粪钙卫蛋白含量较高，且NECⅠ、Ⅱ和Ⅲ期中钙卫蛋白含量也有明显差别[12]。Qu等[6]的Meta分析结果显示，粪钙卫蛋白诊断NEC的灵敏度和特异度分别为0.86和0.79。Meta分析结果显示，钙卫蛋白诊断NEC的特异度和灵敏度分别为0.80、0.86[13]，表明粪钙卫蛋白可能是NEC的潜在生物标志物。另有学者在钙卫蛋白诊断NEC的临界值方面做了进一步研究发现，钙卫蛋白临界值为226 pg/g，阳性预测值为0.56[14]。同样，一项研究通过分析国家参考实验室的5 144个粪钙卫蛋白检测结果的NEC患儿数据，估算0～2个月大婴儿钙卫蛋白的临界值为247 pg/g，阳性预测值为0.47[15]。综上所述，钙卫蛋白在诊断NEC方面具有潜在价值，且能够评估疾病严重程度。上述研究得出的临界值差别不大，但阳性预测值均小于0.6，暂不建议临床用于筛查NEC。因此，需要更多研究来明确钙卫蛋白在早期诊断NEC中的相应临界值，进而辅助临床诊断及评估疾病的严重程度。

2 肠道菌群谱

2.1肠道菌群谱生物活性 肠道菌群谱是包括细菌、真菌、病毒等在内的微生物集合，具有帮助食物消化，调节肠道免疫、代谢产物的合成，防御致病菌肠道内定植等功能[16-17]。其主要通过肠道模式识别受体特异性识别微生物相关分子，并通过促进细胞生长和增殖，调节肠道屏障功能和抗菌肽的分泌来维持肠道稳态，减少病原菌对肠道黏膜的黏附，调节免疫及预防感染，在保护肠道健康方面起重要作用。肠道菌群一旦失调即可导致肠道疾病(如肠易激综合征、炎性肠病)[18-19]，还可能导致内分泌紊乱(如糖尿病)[20]。

2.2肠道菌群谱变化与NEC的关系 NEC的发生与肠道菌群失调密切相关，因此NEC发生前、发生时及发生后的肠道菌群变化成为研究热点。Pammi等[7]的Meta研究分析发现，在NEC发生前变形杆菌相对丰度上调，而厚壁菌门和拟杆菌的相对丰度降低。变形杆菌属于革兰阴性杆菌，其细胞壁主要成分是脂多糖，能识别肠上皮细胞Toll样受体4，促进促炎因子释放，进而引起肠道黏膜屏障损伤[21]。有研究发现，NEC组的物种丰富度和Shannon多样性指数降低，且大肠埃希菌、双歧杆菌以及乳杆菌等有益菌含量显著低于无胃肠道疾病的早产儿组，但NEC组中细菌和克雷伯菌的阳性率较高[22]，表明NEC患儿中肠道菌群的多样性降低，且有益菌减少。Fu等[23]研究发现，NEC患儿克雷伯杆菌和Peptoclostridium丰度显著高于有肺炎或高胆红素血症且无胃肠道疾病及症状的非NEC新生儿，单乳酸杆菌、巴斯德菌和副细菌的丰度显著下降。

目前研究虽尚不能明确导致NEC的菌属，但发生NEC前患儿肠道菌群已发生紊乱，因此菌群种类变化是未来的研究方向。

3 AI-2

3.1AI-2生物活性 群体感应系统是细菌物种之间相互交流的重要途径[24]。近年来发现AI-2是介导细菌之间交流的重要群体感应信号分子，其由细菌LuxS基因编码产生，来源于S-腺苷甲硫氨酸的代谢途径，并广泛存在于革兰阴性菌和革兰阳性菌。AI-2具有调节细菌表达及调控细菌毒力因子的作用，还能促进细菌(如大肠埃希菌、乳酸杆菌)生物膜的形成[25-26]。一般细菌可通过形成生物膜来抵抗外界的不利环境，从而获得持久的生物活性。

3.2AI-2变化与NEC的关系 AI-2作为一种标志物在胃肠道领域已有较多研究，近年其开始作为一种新型粪便标志物进入NEC研究领域。付春燕等[8]测定NEC急性期组(NEC诊断时)、NEC恢复期组(NEC临床症状好转开奶后3 d)、对照组(新生儿肺炎或高胆红素血症且无胃肠道疾病及症状的非NEC新生儿)粪便中AI-2水平，结果显示，NEC急性期AI-2的水平显著低于对照组，在恢复期显著升高。该团队又进一步以NEC动物模型为实验，同样观察到与上述临床研究类似的AI-2变化规律[23]。当引入高表达AI-2的细菌时，肠道紊乱和肠道菌群逐渐恢复。推测急性期由于肠道破坏导致AI-2下降，恢复期时AI-2迅速上升促进损伤黏膜修复及肠道菌群正常，使临床症状好转。研究中还发现无抗生素组AI-2水平明显高于对照组，表明使用抗生素可能会导致AI-2表达下降[8]。推测使用抗生素后肠道内细菌发生变化，导致AI-2表达下降，但目前相关的确切证据不足。因此，AI-2在各个阶段的变化可指导临床早期诊断及推测NEC的发展进程，在检测病情方面具有重要意义。

4 挥发性有机物

4.1挥发性有机物(volatile organic compounds,VOCs)生物活性 VOCs是细菌的代谢副产物，可通过汗液、呼出气体、尿液、粪便等排出。其中粪便中散发的VOCs包括氢气、甲烷、有机酸、杂环化合物、酮等，且能反映肠道微生物组成[27-28]。目前VOCs主要通过电子鼻镜设备进行检测，利用气相色谱-质谱定量及定性检测样品中存在的化合物[29]。VOCs变化或特异性改变可能反映个体的疾病状态。

4.2VOCs变化与NEC的关系 近年学者发现NEC发生时，VOCs发生相应变化。Probert等[30]以1 326名早产儿(<34周)为研究对象，发现NEC患儿粪便VOCs发生变化，且将VOCs归为9类，其中4、5、8三类因子与NEC相关，因子4增加可导致NEC发生风险升高，因子5和8增加导致NEC发生风险降低，推测VOCs可能作为NEC诊断的早期生物标志物。该研究精确到VOCs每一类因子的改变，而不只是模型上的改变，因此受到广泛关注。此外，Hosfield等[27]以小鼠为研究模型，通过Cyranose®320 eNose装置检测出母乳与配方奶组粪便中VOCs无差异，但与NEC组相比差异有统计学意义，即32个传感器中有9个显著不同，表明粪便中VOCs可能反映NEC的发生。

综上所述，VOCs的变化与NEC具有一定相关性，但目前对VOCs的研究主要集中在炎性肠病以及鉴别炎性肠病与肠易激综合征方面[31]，关于NEC的研究数据较少。

5 肠碱性磷酸酶

5.1肠碱性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase，IAP)生物活性 IAP是一种经糖基磷脂酰肌醇键锚定于肠上皮细胞顶膜上的糖蛋白，由肠上皮细胞表达，可在肠腔、血液和粪便中检测到。IAP可使脂多糖(革兰阴性菌细胞壁的主要成分，与其结合可促进炎症的发生)去磷酸化从而减少与肠细胞表面Toll样受体4的结合，减少促炎因子的释放，减轻肠道黏膜损伤[32]。IAP还可以调节肠道表面pH值和肠道中各种菌群的分布，保护肠道中各种共生菌群的生长[33]。

5.2IAP变化与NEC的关系 当敲除大鼠体内IAP基因后，肠道菌群发生移位，且肠道黏膜通透性增加，利于机会病原体定植，导致肠道低度炎症的发生[34]。有实验证明，有剖宫产和配方奶粉喂养等高危因素的NEC患儿IAP活性和转录显著降低，且IAP活性峰值降低，但与生产方式无关[35]。Heath等[36]收集1 360名早产儿(胎龄<37周)粪便并检测IAP水平和活性，也发现严重NEC患儿粪便中IAP水平和活性降低，其阳性率分别为0.97和0.76，高于以往其他已发现的NEC粪便标志物。同时发现IAP水平及转录的降低与脓毒症或其他非感染性胃肠道疾病无关，有望作为诊断NEC的粪便标志物。

虽然以上研究表明在NEC发生时IAP的表达下降，且准确性、特异性较高，但目前在NEC方面的相关研究相对较少，仍需要进一步研究。

6 S100A2蛋白

6.1S100A2蛋白生物学活性 S100A2是S100家族成员之一，编码基因与组成钙卫蛋白的二聚体S100A8/9的编码基因位于同一条染色体，在结构和功能上具有相似性。S100A2可在巨噬细胞、粒细胞和单核细胞中表达，主要由中性粒细胞分泌[37]。当S100A12与锌、钙螯合后可识别细胞表面晚期糖基化终末产物受体，通过核因子κB途径上调IL-1β，同时也可成为Toll样受体4的配体，促进单核细胞激活促炎因子(如IL-6、IL-8)释放，从而导致肠道炎症的发生[38-39]。

6.2S100A12蛋白变化与NEC的关系 目前有研究提示粪S100A12蛋白与NEC的发生存在一定相关性。研究发现，极低体重(<1 000 g)NEC患儿粪S100A12水平与细菌总数及大肠埃希菌计数呈正相关，但S100A12与乳杆菌、双歧杆菌、脆弱芽孢杆菌无相关性[40]。Däbritz等[41]研究发现，NEC早产儿粪S100A12水平高于非NEC早产儿，且NECⅢ期时S100A12中位数高于NECⅡ期(1 200 mg/kg比241 mg/kg)，同时估测出其诊断NEC的理想截断值约为65 mg/kg，灵敏度为0.76，特异度为0.56，而且有18例婴儿在NEC临床发作前1～2周S100A12升高。另一项研究发现，粪S100A12水平在NEC发生后显著升高，但在NEC发生前未升高，可能提示疾病的进展情况[42]。

综上，推测S100A12升高可能是早期诊断NEC和预测疾病严重程度的潜在粪便标志物。但有研究指出，健康婴儿中也可能出现S100A12升高[43]，所以S100A12在NEC诊断上具有局限性，仍需更多研究探索S100A12与NEC发生的关系。

7 乳铁蛋白

7.1乳铁蛋白生物学活性 乳铁蛋白是一种重要的非血红素铁结合蛋白，是中性粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白。乳铁蛋白可通过降低铁的利用率抑制细菌生长，增强吞噬细胞的活性，调节宿主对微生物的吞噬作用。因此，其不仅能够防御有害微生物入侵，还能预防全身炎症反应[44]。乳铁蛋白室温下可在粪便中稳定数天，冷藏条件下则可以持续更长时间。

总之，乳铁蛋白含量检测对NEC的早期诊断和严重程度具有一定的价值。但目前关于乳铁蛋白的研究主要集中在成人炎性肠病[48]，乳铁蛋白与NEC的研究较少，有待进一步研究验证。

8 人β-防御素

8.1人β-防御素(human β-defensin，HBD)生物活性 HBD是一种抗菌肽，具有明显的抗微生物作用，能够有效地抵抗细菌、真菌及病毒等微生物的入侵，进而调节肠道微生态与宿主的适应，是人类的第一道天然防线。HBD1由肠上皮细胞组成性表达，而HBD2主要是在机体发生感染或炎症过程中被诱导性表达，其于1997年在银屑病皮肤患者中首次发现[49]。研究发现，发生肠道炎症时HBD2含量增加，HBD2含量与肠道菌群及大肠埃希菌计数呈正相关，全身应用HBD2可减轻肠道炎症反应[50-51]。HBD3可以显著降低自噬激活蛋白的表达，下调炎症介质的表达，并促进肠道黏膜的完整性[52]。

8.2HBD变化与NEC的关系 研究发现，生理情况下极早产儿生后粪便HBD1和HBD2含量开始下降，2～4周维持在基线水平。在发生中度NEC时，粪便HBD2含量显著增加，但是重度NEC在发病前后HBD2无明显变化[53]。郭静等[54]研究收集31例NEC早产儿和38例非NEC的早产儿入院当日、确诊后2 d及出科当日的粪便，发现粪便HBD1和HBD2含量明显低于同期住院的非NEC早产儿，表明HBD1和HBD2含量与NEC病情严重程度相关。

基于以上研究结果，HBD能否作为辅助NEC诊断和反映病情变化的生物标志物有待进一步研究。

9 小 结

近年来，随着医学检测技术的进步，对NEC粪便标志物的研究越来越多。目前研究较多的钙卫蛋白、肠道菌群谱及研究较少的AI-2、挥发性有机物等对NEC的早期诊断、病情评估及预后等有一定的敏感性和特异性，但均未估算出明确的截断值，且在诊断方面未达成一致观点。相信随着NEC病因及发病机制的不断深入研究及检验技术的进步，将会发现一种或几种理想的非侵入性粪便生物标志物，以帮助早期诊断NEC及评估病情变化。