液体活检在前列腺癌诊治中的研究进展

董振坤，张璐，陈辉

(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院泌尿外科，哈尔滨 150081)

液体活检是指利用体液作为样本来源检测获取相关疾病信息的技术，是继高通量测序技术后应用于肿瘤基因诊断的新突破。作为组织学检测的补充手段，液体活检具有成本低、不良反应小、可重复取样、有效应对肿瘤异质性等优点[1]。同时，液体活检以体液中脱落的肿瘤细胞和肿瘤细胞的基因片段作为检测标志物，实现了与组织活检的一致性[2]。脱落的肿瘤细胞或肿瘤细胞的基因片段主要包括可以从体液中纯化并分析以确定肿瘤特异性突变、拷贝数变异、基因重排和其他肿瘤导致的遗传异常的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)、细胞游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和基于微RNA(microRNA，miRNA)的外泌体等[3]。液体活检具有广泛的应用前景，其不仅在疾病诊断、疗效判断及疾病监测等方面发挥重要作用，同时为临床医师和患者提供了一种无创、实时、低样本量、高效且分析全面的肿瘤基因诊疗技术。

目前，治疗前列腺癌面临的挑战是需要进行连续的组织活检来捕捉前列腺癌不断演变的基因异质性，由于进展的时间周期通常以年为单位进行计算，在临床实践中很难实现。前列腺癌组织活检的另一挑战是在临床转移时，扩散的主要部位为骨骼，这增加了活检取样的难度，且在技术上很难获得用于基因检测的基于肿瘤组织的样本。而采用CTC和基于游离核酸的液体活检技术为克服传统肿瘤活检技术不足提供了一种潜在的解决方案。现就各种基于液体活检的生物标志物检测在前列腺癌中的研究进展予以综述，以为前列腺癌患者的临床诊疗提供新思路。

1 基于CTC的液体活检

1.1液体活检的重要来源 CTC是自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。其来源于原发肿瘤组织，是肿瘤细胞转移的重要方式，也是复发和激发肿瘤致死机制的重要因素。随着实体肿瘤的生长，周围微环境发生了特定变化，有一部分肿瘤细胞会获得异常的活动能力。CTC不仅包含肿瘤的DNA信息，同时还包含基因组、蛋白质组等信息，是研究肿瘤组织信息的重要来源。为了评估治疗选择压力下不断演变的前列腺癌的潜在异质性，CTC可作为一种无创的方式用来研究前列腺癌的分子特征[4]。CTC的富集方法可以分为生物化学特性富集法和物理特性富集法。其中，生物化学特性富集法主要通过细胞表面特异性表达的蛋白标志物分离靶细胞。物理特性富集法主要根据CTC的大小、密度、力学和介电性能等物理特性将CTC筛选出来。在前列腺癌的发生发展过程中，不仅CTC的数目在动态变化，CTC所携带的分子标志物也在变化。因此，通过检测CTC表面标志物，能够反映肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。目前，转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC)中的CTC计数已被美国食品药品管理局批准作为一种预后标志物，并已在前瞻性试验中得到证实[5-6]。

1.2CTC对前列腺癌治疗反应的预测作用 CTC检测可以预测前列腺癌患者的治疗反应，指导前列腺癌的治疗。通过对前列腺癌患者内分泌治疗反应的预测，特别是对进展到去势抵抗性前列腺癌阶段患者治疗反应的预测，可以有针对性地选择化疗或者新型内分泌治疗。Riaz等[3]使用CTC AdnaTest前列腺癌平台从7.5 ml血液中捕获CTC，进行CTC分离和富集后，采用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测细胞中雄激素受体全长和雄激素受体剪切变异体7(androgen receptor splice variant 7，AR-V7)的表达。结果显示，可通过基于CTC的AR-V7的检测与血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)相结合评估前列腺癌患者对内分泌治疗的反应。另一项使用相同CTC平台对202例应用阿比特龙或恩扎鲁胺治疗的mCRPC患者进行的大规模前瞻性研究中，采用基于CTC的AR-V7信使RNA检测评估了CTC检测和AR-V7检测的预后价值，结果显示，CTC阴性患者效果最好，CTC阳性/AR-V7阴性患者效果稍差，CTC阳性/AR-V7阳性患者效果较差[7]。另外，CTC检测可以对治疗反应进行预测，在该研究中有26%的mCRPC患者没有检测到CTC，有75.5%的CTC阴性患者观察到对阿比特龙或恩扎鲁胺治疗的反应[7]。上述研究表明，CTC中表达的AR-V7是一个潜在的预测生物标志物，且与阿比特龙和恩扎鲁胺耐药相关。

1.3CTC对前列腺癌预后的评估作用 CTC检测具有无创和可重复的特点，通过检测CTC特异性表达的蛋白标志物水平，可以评估前列腺癌患者的预后。Armstrong等[8]对118例接受雄激素受体抑制剂治疗的mCRPC患者进行前瞻性临床试验，观察CTC中的基线AR-V7水平是否对患者接受抗雄激素治疗的预后有预测意义。结果表明，AR-V7阳性患者的平均无进展生存期为3.1个月，而阴性患者为6.1个月；总生存期的差异则更显著，AR-V7阳性患者的总生存期为8个月，而阴性患者总生存期超过2年。因此，AR-V7阳性的患者不应继续接受抗雄激素治疗，而应改为化疗或其他治疗。AR-V7作为治疗反应生物标志物的作用不仅限于雄激素受体抑制剂，其中AR-V7阴性转化为阳性常发生于接受雄激素受体抑制剂治疗的患者，而AR-V7阳性转化为阴性只发生在接受紫杉醇化疗的患者中[9]。因此，通过CTC检测可以对前列腺癌治疗进行动态的监测，有效评估前列腺癌患者的预后。

目前，基于CTC分子预测的应用主要受限于CTC检测能力，而检测CTC的能力又取决于前列腺癌所处的阶段。由于全血CTC的检出率在早期阶段和无转移状态非常低，在疾病早期，基于CTC的检测方法的应用价值有限，需要进一步完善检测平台以提高检测敏感性，并在临床实践中使用最合适的检测参数和分子标记。

2 基于cfDNA和ctDNA的液体活检

2.1cfDNA和ctDNA的来源 cfDNA是血浆等体液中的游离DNA，是不包含在完整细胞结构内的DNA，其以裸露核酸的形式存在且高度片段化，可由正常细胞或异常细胞(如肿瘤细胞)等产生，可应用于肿瘤学、器官移植排异监测及产前诊断等领域。而ctDNA是指肿瘤细胞释放的、携带肿瘤基因信息的DNA片段(包括突变、缺少、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等)，是cfDNA的一部分，在肿瘤诊疗中研究最为广泛。ctDNA可以通过高通量测序获得全基因组分析的数据，进而通过基因检测指导靶向药物临床应用。ctDNA的基本特征为水平低，根据已有研究，ctDNA在cfDNA中占0.01%～1%，且受瘤种和疾病期别等因素的影响[10]。在晚期前列腺癌患者血浆中ctDNA的水平较高，研究也相对较多，而ctDNA在早期前列腺癌中的研究则受限于ctDNA水平。近年来，ctNDA的相关研究取得了突破性进展，随着多种检测技术的升级，ctDNA检测的敏感性和特异性均得到大幅度提高。

2.2cfDNA和ctDNA在前列腺癌中的应用 ctDNA在前列腺癌的精准治疗中具有重要作用，可以替代组织标本进行基因检测，特别是在无法获得组织标本的患者中，ctDNA提供了新的检测途径。同时，ctDNA解决了前列腺癌组织活检肿瘤异质性的问题，可以准确反映前列腺癌的基因改变。此外，ctDNA在转移性激素敏感性前列腺癌和mCRPC患者中均与不良预后相关，可作为预后判断的标志物。另外，ctDNA与治疗反应相关，可以对系统治疗反应进行评估。研究发现，与基线水平相比，患者接受雄激素受体抑制剂(如醋酸阿比特龙和恩扎鲁胺) 治疗后ctDNA水平明显降低[11]。而一项试验发现，对标准治疗无效且DNA修复基因缺陷的前列腺癌患者使用PARP抑制剂奥拉帕利治疗4周后，患者血浆cfDNA总下降率超过50%且与无进展生存期相关，表明cfDNA具有预后判断意义[12]。cfDNA作为晚期前列腺癌的生物标志物，不仅可以通过血液标本检测，还可以通过尿液进行检测。在一项针对转移性激素敏感性前列腺癌患者使用雄激素剥夺治疗和mCRPC患者中使用多西他赛化疗的研究中，学者对尿样cfDNA进行了全基因组测序，以确定肿瘤相关的拷贝数变化，结果显示拷贝数分析能够检测到常见的基因组异常，并在50%的CRPC患者中检测到雄激素受体扩增[13-15]。

尽管cfDNA是理想的前列腺癌早筛生物标志物，但其面临的技术挑战也不容忽视。首先，需要获得健康人的cfDNA基线，cfDNA有独特的断裂方式，释放到血浆中的cfDNA并不是均匀覆盖基因组，因此健康人基线对于灵敏度检测非常关键。其次，为获得合理的测序深度和染色体结构变异算法，需要不断的技术优化。最后，能否检测到前列腺癌特异的染色体结构变异并以此作为肿瘤早筛的分子标记，尚需要积累更多样本并借助大数据来积累更多的证据。

3 基于外泌体的液体活检

3.1外泌体的功能 外泌体是多泡小体与质膜融合时释放到细胞外环境中的小囊泡，含有从亲代细胞选择性富集的RNA。外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、长链非编码RNA、环状RNA、信使RNA以及其降解片段，参与细胞重要活动的调控。外泌体是细胞间信息交流的重要组成部分，肿瘤细胞经常以外泌体为生物媒介从而促进实体瘤的生长。同时，外泌体在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、疾病耐药等方面具有重要研究价值。血浆外泌体RNA可作为前列腺癌患者的诊断、预后甚至治疗的生物标志物。

3.2外泌体RNA检测在前列腺癌中的应用 等离子体来源的外泌体RNA是前列腺癌AR-V7检测的重要来源，通过外泌体RNA检测可以监测前列腺癌患者的疾病进展及评估治疗反应。2016年，研究首次证实可以从癌细胞小泡中提取的RNA进行AR-V7检测，在一项对26例前列腺癌患者接受阿比特龙和恩扎鲁胺治疗的研究中，61%的患者AR-V7呈阴性，且AR-V7阴性患者的中位无进展生存期、总生存期明显长于AR-V7阳性患者，表明在前列腺癌患者中进行AR-V7 RNA检测具有一定预后意义[16]。此外，一项针对mCRPC患者的研究进行了血浆外泌体miRNA的RNA测序，使用实时定量聚合酶链反应进一步评估miRNA的预后价值，结果发现375个已知和57个新的miRNA，同时发现miR-1290、miR-1246和miR-375与总生存期相关；另外，该研究还发现miR-375可通过靶向SEC23A和Yes相关蛋白1基因诱导前列腺癌多西他赛耐药，所以miR-375也可以作为多西他赛耐药的预测生物标志物[17-18]。以上研究证实，外泌体RNA是前列腺癌的生物标志物，是前列腺癌相关RNA检测的重要来源，同时外泌体RNA也为前列腺癌相关RNA检测提供新途径。

外泌体作为细胞间通讯的重要介质，参与前列腺癌微环境中多种细胞之间的生物信号传递及前列腺癌发生和发展过程。虽然外泌体应用的前景广阔，但目前仍处于研究阶段，其提取、纯化的技术难度较高，还缺乏更加经济有效的分离技术。此外，并非所有前列腺癌特征均能够通过RNA突变表现出来，故外泌体作为目前研究的热门领域，其在前列腺癌中的形成与分泌机制还需深入研究。

4 基于尿液RNA的液体活检

4.1尿液前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3，PCA3)检测 前列腺癌可以释放具有肿瘤特异性的游离RNA到尿液中，通过检测尿液相关标志物可以对前列腺癌进行早期诊断。PCA3是一种具有高度特异性的前列腺癌特异性抗原，它是编码在染色体9q21～22上的非编码RNA[19]，在前列腺正常组织中不表达，在前列腺增生组织中低表达，但在前列腺癌组织中高表达。研究表明，尿液PCA3与血清PSA水平升高相关，对PSA水平升高的患者在穿刺活检前进行前列腺按摩后的尿液检测显示，PCA3预测恶性肿瘤的灵敏度为69%，特异度为79%[20]。因此，尿液PCA3是前列腺癌筛查的潜在生物标志物，但仍需进行大样本临床试验证实尿液PCA3的检测可降低前列腺癌的病死率。

4.2尿液PCA3检测的诊断价值 尿液PCA3联合PSA检测可以提高前列腺癌的检出率，特别是对需要二次穿刺活检的患者具有指导意义。在一项包括1 140例患者的PCA3试验中，所有血清PSA水平中度升高前列腺活检为阴性的患者PCA3与再活检阳性率显著相关，并与Gleason评分相关[21]。同时，包括12 265例接受PCA3检测患者的荟萃分析显示，尽管没有区分首次活检和重复活检，但检测前列腺癌的灵敏度和特异度分别为65%和73%[22]。另外，雌激素受体基因(estrogen receptor gene，ERG)的基因融合是前列腺癌中常见的分子改变，对前列腺癌患者尿液中跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)-ERG融合检测的研究发现，其诊断的特异度高达93%，阳性预测值为94%，但联合尿液PCA3和TMPRSS2-ERG RNA融合检测高Gleason评分肿瘤的灵敏度仅为37%[23-24]。而另一项研究中，在保留95%灵敏度的阈值下联合两种检测方法也仅能将前列腺癌的诊断特异度从18%提高至39%[25]，因此联合检测的价值需进一步的前瞻性研究证实。PCA3评分的增加预示着前列腺癌风险的增加，并可预测活检的结果，PCA3联合血清PSA和其他危险因素可显著提高诊断准确率。另外，尿液PCA3和TMPRSS2-ERG检测虽不是晚期前列腺癌分期的可靠依据，但可用于评估晚期前列腺癌对抗雄激素治疗的反应。

4.3尿液miRNA检测的价值 miRNA是在前列腺癌细胞、尿沉淀物和外泌体中均可检测到的以游离形式存在的长度为18～25个核苷酸的短小非编码RNA，可通过分解特定靶信使RNA或抑制其翻译来阻止蛋白质表达而发挥作用[26]。尿液miRNA检测对前列腺癌具有诊断价值，研究表明，前列腺癌患者尿沉淀物中的miR-107和miR-574-3p水平明显高于对照者[27-28]。此外，前列腺癌患者尿液中miR-183和miR-205检测前列腺癌的灵敏度和特异度分别为80%、72%和19%、26%，而两种miRNA联合检测前列腺癌的灵敏度和特异度分别为60%和69%[29]。另有研究表明，直肠指检后尿液标本中可检测到miR-183和miR-205，而两种miRNA联合检测前列腺癌的灵敏度和特异度分别为90%和3%[30]。miR-183和miR-205虽然在癌组织中高度异常表达，但对早期前列腺癌诊断价值有限。在不同分期的前列腺癌中，不同风险特征的miRNA表达谱存在差异，但基于前列腺癌不同分期miRNA的研究，由于缺乏临床相关证据，目前仍处于研究阶段。

5 小 结

精准医学根据分子特征识别可以接受特定治疗的患者亚群，彻底改变了人们对前列腺癌的理解和治疗。基于CTC、cfDNA、ctDNA和外泌体检测的液体活检技术可以预测前列腺癌的进展和预后，并更有效地确定合适的精准治疗方案，在前列腺癌诊断和治疗中发挥重要作用，是前列腺癌最具前景的无创检测技术。但液体活检广泛应用于临床也面临诸多挑战，不仅需要检测技术敏感性和特异性的提高、临床研究的积累，还需要建立相应的检测标准和建设规范的监管体系。随着液体活检标志物的精准识别和检测技术的发展，未来液体活检技术将为临床医师和患者提供最前沿且稳定的肿瘤诊断方式。