环状RNA的生物学功能及其在不同分子分型乳腺癌中的研究进展

伊茹，蔡凤林，符德元

(1.大连医科大学，辽宁 大连 116044； 2.江苏省苏北人民医院甲状腺乳腺外科，江苏 扬州 225001)

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类具有共价闭环结构，没有5′端7-甲基鸟苷三磷酸“帽子”和3′端多聚体“尾巴”的非编码RNA。circRNA包括外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA和基因间circRNA四类[1]。circRNA由前体信使RNA(messenger RNA，mRNA)环化形成，多数存在于细胞质，也有一些内含子形成的circRNA存在于细胞核[2]。经典RNA检测方法通常只能识别RNA分子的多聚体“尾巴”结构，故circRNA在既往研究中常被忽略[3]。circRNA最早于1976年在植物病毒中被发现，其具有特殊的形态学特征，对核酸外切酶的耐受性高，较亲本线性RNA更稳定[4]。现已鉴定出真核生物中20 000多种circRNA，它可以存在于外泌体，并随外泌体在体液(如血液、尿液、唾液)和母乳中循环[5]。由于其进化保守性、结构稳定性以及组织表达特异性，circRNA可能在肿瘤中作为特殊的分子标志物发挥作用。

乳腺癌是女性中最常见的癌症，也是全球癌症死亡的主要原因，其分子特征及临床表型具有高度异型性[6]。circRNA不仅参与调控乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，还可能是乳腺癌早期诊断、个体化预后评价的新型分子标志物。现对circRNA作用于不同分子分型乳腺癌的机制予以综述，以期为寻求更有价值的乳腺癌应对策略和更精确的靶向疗法提供新思路。

1 circRNA的生物学功能

近年来，随着大量circRNA的发现，其与肿瘤和其他疾病相关的生物学功能逐渐显现。circRNA可通过调节特定基因表达，参与细胞生长、信号转导、受体激活等过程，从而影响人类疾病的发生。circRNA的生物学功能包括：通过circRNA-微RNA(microRNA，miRNA)-mRNA轴发挥海绵作用，翻译蛋白质；调控亲本基因表达；与RNA结合蛋白相互作用等。

1.1海绵作用 circRNA作为竞争性内源RNA发挥其特定功能。circRNA分子富含miRNA结合位点，可通过miRNA应答元件吸附miRNA，并负调控miRNA活性，因此被视为“miRNA海绵”[7]。ciRS-7(也称为cDR1as)是第一个被定义为“miRNA海绵”的circRNA，ciRS-7包含70个以上miR-7保守结合位点，可在致癌基因和抑癌基因复杂网络的调节中起作用，并可显著抑制miR-7活性，促进miR-7靶向致癌因子上调，从而调节肿瘤细胞的增殖[8-9]。多种circRNA在乳腺癌进程(细胞增殖、侵袭、迁移和耐药性)中被激活，其中包括一些上调的circRNA，如hsa_circ_100876通过抑制miR-361-3p的表达促进乳腺癌细胞的增殖和转移[10]。circTADA2A-E6是由转录适配器2A经反向剪接形成的circRNA，它可作为miR-203a-3p和miR-302c-3p的海绵，促进乳腺癌细胞的转移[11]。circCER作为海绵抑制miR-136的活性，导致乳腺癌细胞增殖和迁移增加[12]。对阿霉素耐药乳腺癌组织的研究证实，hsa_circ_0006528在阿霉素耐药的人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231细胞中上调[13]。下调的circRNA，如hsa_circ_000911通过使miR-449a海绵化正向调控跨膜受体蛋白Notch1表达，抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[14]。hsa_circ_0072309通过调控miR-492增加G0/G1期阶段的细胞数量，抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，抑制乳腺癌进展[15]。circRNA还可通过miRNA海绵调节肿瘤的代谢，如circHIPK3通过调控miR-124抑制糖酵解中关键酶的表达[16]。circGFRA1通过调控miR-34a促进三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)组织中的脂肪吞噬，完成脂质利用[17]。circRNA的海绵作用可对应一个或多个miRNA，现已证实hsa_circ_0001358可与5个miRNA(miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-376a-3p、miR-376b-3p和miR-429)结合[18]。circHIPK3共有18个潜在miRNA结合位点(每个miRNA有1～3个结合位点)，至少可以结合9种miRNA[19]。但仅少数circRNA显示出miRNA海绵特性[20]。

1.2翻译功能 有些circRNA具有翻译功能。circRNA的翻译无法通过依赖5′端7-甲基鸟苷三磷酸“帽子”的调控元件启动，因此需要内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)或其他元件激活不依赖“帽子”结构的途径。有研究证实，一些circRNA具有通过IRES依赖性途径和N6-甲基腺苷依赖性途径编码蛋白质的能力[21]。circZNF609序列存在开放阅读框和非翻译区，且circZNF609的非翻译区能够作为IRES驱动IRES依赖性翻译，证实circRNA具有编码能力。circZNF609可作为miRNA海绵促进乳腺癌进展，也可在肌生成过程中编码蛋白[22]。SHPRH-146aa是circSHPRH产生的一种新蛋白质，可抑制神经胶质瘤的发生[23]。由包含7的F-Box和WD重复域(F-Box and WD repeat domain containing 7，FBXW7)衍生的circRNA——circFBXW7是一种抑癌circRNA，circFBXW7可以编码含有185个氨基酸的肽(FBXW7-185aa)，而FBXW7-185aa可通过诱导癌基因c-Myc的降解，抑制TNBC细胞的增殖和迁移[24]。上述circRNA编码的肽通过干扰肿瘤的新陈代谢或转移发挥抗肿瘤作用[25]。circRNA虽然打破了传统非编码RNA的特性，但与线性对应物相比，环形模板的翻译活性较线性模板低，且具有一定的组织、时序特异性，但不同物种间进化保守。

1.3参与亲本基因调控 circRNA参与了mRNA的前期剪接，并可作为亲本mRNA转录的活性启动子[3]。circRNA通过上调RNA聚合酶Ⅱ的活性刺激其亲本基因转录，从而引发其作为RNA聚合酶Ⅱ正向调节剂的潜在作用[26]。一些外显子-内含子circRNA(如circEIF3J和circPAIP2)可能通过与核小RNA之间的RNA-RNA相互作用，进一步与RNA聚合酶Ⅱ转录复合物在启动子处相互作用，这种非编码RNA之间特异性的RNA-RNA相互作用，可能是非编码RNA功能机制的核心主题之一。外显子-内含子circRNA可能通过调控转录来增加亲本mRNA和自身表达水平[27]。此外，circCNOT2等带有起始密码子的circRNA可能通过启用亲本线性mRNA另一个起始密码子的翻译来影响亲本基因的表达[2]。

1.4与RNA结合蛋白的相互作用 RNA结合蛋白通过调节基因表达，几乎在所有细胞过程中均发挥关键作用，如细胞的增殖、分化、运动、衰老、凋亡以及细胞对应激、有丝分裂原和免疫触发的反应等。circRNA可与不同RNA结合蛋白相互作用形成特定的RNA-蛋白质复合体，从而影响相关蛋白质的作用方式或影响自身生物发生过程[28]。由多聚腺嘌呤结合蛋白核1基因产生的环状多聚腺嘌呤结合蛋白核1与人抗原R结合可能会抑制其介导的翻译过程[29]。在非癌细胞中高表达的circFOXO3通过形成circFOXO3-p21-cDK2三元复合物阻断细胞周期进程[30]。由细胞周期蛋白B1产生的circCCNB1可以与细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白依赖性激酶1相互作用，改变乳腺癌中抑癌基因p53基因突变的影响[31]。此外，circRNA还可作为调节蛋白质-蛋白质相互作用的动态支架分子，作为非编码RNA修饰表观遗传等作用[32]。circRNA通过其特定的生物学功能在肿瘤相关进程中起重要作用，circRNA的生物学功能及其在肿瘤发生发展过程中的作用机制仍需要进一步探索，以为临床工作提供新的诊疗方向。

2 circRNA与不同分子分型乳腺癌

根据免疫组织化学染色显示的乳腺肿瘤关键蛋白的表达将乳腺癌分为雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性乳腺癌、孕激素受体(progesterone receptor,PGR)阳性乳腺癌、人表皮生长因子受体(human epithelial growth factor receptor，HER)2阳性乳腺癌以及缺乏以上3种蛋白质标记的TNBC。研究发现，circRNA不仅与不同分子分型乳腺癌的发生和发展进程有关，且与乳腺癌化疗过程中的不良反应及耐药性密切相关[33]。

2.1circRNA与TNBC 与其他乳腺癌亚型相比，TNBC在年轻女性中更常见，其组织学分级较高，且通常预后不良。circRNA与TNBC细胞增殖和肿瘤生长、侵袭和转移有关，还可调节TNBC细胞对治疗药物的耐药性等[34]。通过RNA测序技术，circRNA在TNBC组织和相邻正常组织之间差异表达，且circRNA表达水平与TNBC患者临床分期和预后密切相关。circSEPT9由SEPT9(Septin 9)前体mRNA经反向剪接环化形成，可通过调控miR-637减轻其对白血病抑制因子的抑制，激活涉及TNBC进程的白血病抑制因子/信号转导及转录激活因子3信号通路，导致TNBC的发生和发展[35]。含有蛋白1的Arf GAP结构域和FG重复序列产生的circAGFG1可通过调控miR-195-5p减少对G1/S期特异性细胞周期蛋白E1的抑制，从而促进TNBC细胞增殖和转移并抑制细胞凋亡[36]。hsa_circ_007294可通过调控miR-148a-3p和miR-152-3p诱导上皮-间充质转化，进而促进TNBC的侵袭和转移[37]。上皮基质相互作用蛋白1产生的circEPSTI1通过调控miR-4753和miR-6809，上调乳腺癌L11A基因的表达，并影响TNBC的增殖和凋亡。高水平circEPSTI1与TNBC患者生存期缩短有关[38]。驱动蛋白超家族成员4A(kinesin family member 4A，KIF4A)产生的circKIF4A通过调控miR-375上调癌基因KIF4A的表达，从而调节TNBC细胞的增殖和迁移[39]。circIFI30通过上调miR-520b-3p靶基因CD44的表达促进TNBC细胞增殖、侵袭[40]。泛素结合酶E2 D2环化产生的circUBE2D2通过调控miR-512-3p调节癌基因CDCA3的表达，与TNBC不良预后有关[41]。circWAC通过调控miR-142减少miR-142对WW结构域E3泛素蛋白连接酶1基因的抑制作用，调节TNBC细胞中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路的传导活性，并影响其对紫杉醇的敏感性[33]。由核受体亚家族C组成员2产生的circNR3C2通过miR-513a-3p促进TNBC中羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶降解蛋白1介导的肿瘤抑制作用[42]。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶降解蛋白1通过诱导泛素化抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭。

2.2circRNA与HER-2阳性乳腺癌 HER-2阳性乳腺癌占所有乳腺癌的20%～30%[43]，具有浸润性强、易复发转移、无病生存期短等特点。对HER-2阳性乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中circRNA差异表达谱的研究发现，差异表达的circRNA在磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路中显著富集，并与蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶调控活性显著相关[44]。HER-2阳性乳腺癌细胞中，circRNA表达谱与正常乳腺上皮细胞表达谱存在显著差异，差异表达的circRNA可作为HER-2阳性乳腺癌的潜在诊断或治疗靶标。有研究表明，与其他亚型乳腺癌患者相比，HER-2阳性乳腺癌患者差异表达的circRNA数目更多[45]。TNBC和HER-2阳性乳腺癌样本中circ-HER2(一种HER-2基因的环状形式)的表达高于邻近正常组织，且circHER2的状态与总生存时间呈负相关[45-46]。此外，circHER2还编码蛋白质HER-103。所有HER-2阳性乳腺癌细胞系及部分TNBC细胞系均表达HER-103，而Luminal型乳腺癌细胞系不表达HER-103[46]。HER-103在HER-2阳性乳腺癌中的作用还有待进一步研究，但其表达可能提示circRNA不仅通过miRNA在乳腺癌中发挥作用，其翻译功能编码的蛋白质也可能是调控乳腺癌发生发展过程中的关键环节。

2.3circRNA与Luminal型乳腺癌 约70%的乳腺癌为激素受体阳性[43]。已知大量circRNA可被雌激素诱导，对PGR基因产生的雌激素诱导程度最高的6个 circRNA(circPGR1～6)的研究发现，circPGR作为竞争性内源RNA可调控miR-301a-5p的作用，促进ER阳性乳腺癌细胞的生长和肿瘤发生[47]。circPGR在ER阳性乳腺癌细胞系中高表达，而靶向circPGR的反义寡核苷酸可有效抑制乳腺癌细胞的生长，ER阳性乳腺癌中hsa_circ_0087378下调，且hsa_circ_0087378/miR-1260b/分泌型卷曲相关蛋白1轴也被认为是调控ER阳性乳腺癌进程的关键途径[47-48]。hsa_circ_0025202通过调控miR-182-5p抑制乳腺癌细胞进展，并提高乳腺癌细胞对他莫昔芬内分泌治疗的敏感性[49]。通过在线微阵列分析(Gene Expression Omnibus)研究发现，与非肿瘤组织相比，Luminal亚型乳腺癌组织中存在多个差异表达的circRNA，hsa_circRNA_100689和hsa_circRNA_005239可能参与了Luminal亚型乳腺癌的发生、发展与分子调控进程[50]，这可能有助于新型Luminal亚型乳腺癌治疗靶点的研究。

circRNA在乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和耐药中发挥了巨大的调控功能。目前，circRNA与乳腺癌的相关性研究主要集中于其作为竞争性内源RNA的海绵作用，circRNA通过翻译功能和结合RNA结合蛋白调控乳腺癌的潜力有待进一步挖掘。与传统肿瘤生物标志物相比，circRNA在肿瘤诊断及其预后判断中的灵敏度和特异度更高，在乳腺癌等肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。circRNA的环状结构稳定，使其在血液或尿液中的半衰期延长，为circRNA作为生物标志物提供了条件[51]。此外，结合乳腺癌中特异表达的蛋白与差异表达的circRNA有望成为新的治疗靶点。

3 小 结

circRNA的生物发生不是随机的剪接错误，是RNA家族中继miRNA后发现的又一种重要肿瘤调节因子。circRNA存在于所有生命形式(包括真核生物、细菌等)中，证明了circRNA的重要性。乳腺癌发病率和复发率均较高，因此急需寻找有效的诊断与治疗方法，不同circRNA以及传统标志物的同时检测可能具有更高的诊断效率。circRNA在癌症治疗中的潜力亦受到重视。靶向circRNA的治疗可能成为肿瘤治疗的一种新模式。目前已根据真核生物circRNA的来源、功能、体内分布等建立了统一的归类方法，有助于进一步探索其作为诊断性生物标志物以及疾病治疗靶标的潜力。