代谢组学在滥用物质毒理学研究中的应用

严秀莺，向平，于治国，严慧

1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳110016

滥用物质是指连续使用后产生依赖性并具有滥用倾向的精神活性物质，可显著影响人类的精神活动，包括认知、情绪、意识、意志与行为等[1]。近年来，随着全球打击贩毒力度的加大，毒贩为逃避执法打击，对已经列管的毒品进行化学结构的修饰改造，从而得到新精神活性物质[2]。这类物质有着与毒品类似的功效，可令人产生吸毒一样的快感，甚至更强的兴奋、致幻或麻醉作用。同时由于这类物质的新颖性，以及缺乏系统的临床药理毒理研究过程，目前对其毒性作用机制和药物依赖形成机制的研究较少。

代谢组学能够捕捉外部刺激对内源性代谢物的影响，分析参与维持生长和正常功能所需所有小分子。通过比较正常状态和扰动状态，可以突出作为刺激直接结果的代谢物水平差异，随后将其映射到特定的代谢途径，从而更好地理解这种刺激效应[3]。代谢组学的作用主要在于代谢物的整体测定，或观察由于药物毒性或特定疾病引起的生物标志物的增加或减少[4-5]，因此，近年来引起了毒理学和病理学领域越来越多的关注[6-7]。目前，已有研究将代谢组学技术应用于分析药物滥用的成瘾机制和毒性作用机制[8-9]。通过筛选生物标志物，并将其归属到相应的代谢途径，判断扰动因素对内源性代谢途径的影响，从而对扰动机制进行探索。同时通过比较当前药物滥用者的表型、戒断期、戒断持续时间、复发或无药物使用的代谢组学谱，可以确定与成瘾阶段相关的生物标志物[10]。因此，代谢组学不仅可用于研究药物滥用与机体的相互影响，而且也能应用于药物滥用相关的生物标志物研究。因此，本文对代谢组学在滥用物质的应用进展进行综述。

1 运用代谢组学研究滥用药物毒性作用机制

代谢组学可在整体水平上灵敏而全面地阐释机体在滥用物质作用后的内源性代谢物的变化，从而对其毒性作用机制进行解释。

1.1 阿片类物质

阿片类物质是指具有与吗啡类似的药理作用、对阿片受体有亲和性的一类物质。这类物质除了天然成分（如鸦片、吗啡、罂粟碱等）外，还包括半合成化合物（如海洛因、丁丙诺啡、福尔可定等）、全合成化合物（如美沙酮、哌替啶、芬太尼等）[1]。吗啡是众所周知的μ-型阿片受体激动剂，通过抑制腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）的γ -氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）能神经元间接增加多巴胺水平[11-12]。海洛因是吗啡二乙酰化半合成的药物。由于其高亲脂性，更容易通过血脑屏障，具有比吗啡更高的药效[13]。为了研究海洛因对大脑代谢组的影响，LI 等[14]开发了一种基于超高压液相色谱飞行时间质谱仪（ultra high performance liquid chromatography time of flight mass spectrometry，UPLC-TOF/MS）的代谢组学方法，对海洛因给药小鼠的大脑代谢物进行分析，结果发现，海洛因不仅会破坏小鼠大脑的能量代谢，还会破坏儿茶酚胺和褪黑素的生物合成，它还引起肝损害，破坏相应的代谢途径，谷胱甘肽、牛磺酸、核黄素、4-吡啶甲酸、叶酸和蛋氨酸是重要的代谢生物标志物，也可能是海洛因致肝损伤的重要靶点[15]。LI 等[16]发现区分鸦片使用者（n=218）和非鸦片使用者（n=80）的内源性化合物主要包括维生素和辅助因子，以及参与神经传递、克雷布斯循环、嘌呤代谢、中心碳代谢、组蛋白修饰和乙酰化的代谢物。曲马多是一种中枢性镇痛药，也是一种低亲和力阿片受体激动剂，用于治疗中度或重度疼痛。JIANG 等[17]采用非靶向代谢组学和串联质谱标签（tandem mass tags，TMT）标记定量蛋白组学对曲马多给药组和对照组进行研究。差异表达的代谢物主要涉及蛋白质的摄取和吸收、脂肪酸生物合成、类固醇激素生物合成和胆汁分泌。通过对小鼠的大脑代谢组学研究发现，长期滥用曲马多可导致氧化损伤、炎症和GABA 神经递质系统的破坏，这将有助于阐明曲马多滥用的毒作用机制[18]。

1.2 可卡因与苯丙胺类物质

可卡因与甲基苯丙胺均为中枢神经兴奋剂，但作用机制略有不同。甲基苯丙胺能从突触前囊泡释放单胺到伏隔核突触间隙并抑制其再摄取，而可卡因仅表现出对单胺再摄取的抑制作用[19-20]。虽然目前可卡因和甲基苯丙胺的作用机制已经有一些研究，但代谢组学有望揭示新的发现或隐藏的作用机制。

COSTA 等[21]对可卡因滥用者和健康志愿者的血清进行了基于1H-核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）的代谢组学研究，发现可卡因滥用主要造成能量代谢紊乱、组胺生物合成受损以及多巴胺浓度改变。而另有研究[22]表明，多巴胺水平的增加能药理性降低痛觉，因此多巴胺浓度增高可能与可卡因的麻醉作用相关。SÁNCHEZ-LÓPEZ 等[23]研究了可卡因组、酒精组、可卡因+酒精组以及对照组4 组之间的生物学差异，结果发现，受影响的主要是氨基酸代谢相关的途径。可卡因与乙醇联用时，不仅血浆中可卡因的水平会增加，乙醇和可卡因结合还会形成精神活性代谢物，这种精神活性代谢物具有毒性，会使血压升高、心率加快。

甲基苯丙胺是众所周知的突触前血清素，促进多巴胺和去甲肾上腺素的有效释放，抑制再摄取，这些作用导致了中枢神经系统的整体刺激。甲基苯丙胺中毒会导致肝、心、肾和性腺的功能障碍以及精神病，甚至死亡[24-25]。SHIMA 等[6]通过分析尿液和血浆代谢组学特征，发现了急性甲基苯丙胺中毒的外周效应，提示甲基苯丙胺可引起外周系统能量代谢的紊乱。MCCLAY 等[26]也发现，单次给予甲基苯丙胺也会导致能量代谢的紊乱。然而，两个团队研究结果却存在差异，可能源于采样时间点、剂量和目标区域的差异。

3，4-亚甲双氧甲基苯丙胺（3，4-methylenedioxy-N-methylamphetamine，MDMA）作为苯丙胺类中的一种“明星药物”，具有兴奋和致幻特性，同时也是一种著名的肝毒性药物。ARAÚJO 等[27]对MDMA 亚急性中毒小鼠肝细胞的代谢影响进行了研究，发现其主要涉及三羧酸循环、脂肪酸代谢、谷氨酸代谢、抗氧化防御等。此外，MDMA 单次摄入就会干扰类固醇代谢和炎症途径[28]。NIELSEN 等[29]还将不同浓度的MDMA阳性全血样品与阴性对照样品进行了比较，结果发现，几种酰基肉碱都发生了变化，这些内源性代谢物的变化可能与能量需求增加、血清素能综合征以及药物引起的神经毒性机制有关。

1.3 氯胺酮

氯胺酮具有麻醉作用，同时由于其与苯环利啶有相似的化学结构，也具有较强的致幻作用。CHEN等[30]研究了反复滥用氯胺酮对大鼠前额叶皮层、海马和纹状体的影响，发现前额叶皮层更有可能是氯胺酮长期作用的靶区，嘌呤和甘油磷脂代谢是氯胺酮神经毒性的主要通路。此外，WEN 等[31]还发现长期氯胺酮滥用会导致膀胱壁中转凝蛋白的磷酸化，这可能是氯胺酮相关性膀胱炎的重要发病机理。WU 等[32]也发现，亚油酸代谢、丙氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢与氯胺酮引起的膀胱炎有密切关系。也有学者[33]研究了氯胺酮对血清内源性代谢的影响，发现主要造成脂质代谢和氨基酸代谢的紊乱。

除麻醉与致幻作用外，氯胺酮亦具有抗抑郁作用。根据多年的广泛研究，海马是参与重度抑郁症复杂机制的关键大脑区域之一[34]。据报道[35]，重度抑郁症患者的海马体积明显减少，也有证据表明抗抑郁药会影响海马功能。因此，LIAN 等[36]采用气相色谱-质谱联用代谢组学方法评价氯胺酮对小鼠海马的影响，发现主要影响氨基酸代谢、能量代谢和氧化应激代谢。WECKMANN 等[37]也运用LC-MS 对氯胺酮滥用的小鼠进行了时间依赖性海马代谢物谱分析，结果显示，包括糖酵解/糖异生、戊糖磷酸途径和柠檬酸循环在内的多个海马通路受到影响。

1.4 新精神活性物质

新精神活性物质主要包括芬太尼类、合成大麻素类、合成卡西酮类、苯乙胺类、色胺类等。由于新精神活性物质的新颖性，目前对其作用机制研究较少，故使用代谢组学方法寻找其毒性线索。

卡芬太尼是一种芬太尼类似物，其药效比芬太尼强100 倍。目前，对于卡芬太尼的了解大部分是基于对临床使用的芬太尼和相关类似物。为了研究卡芬太尼的作用机制，DHUMMAKUPT 等[38]对暴露在极低水平的雾化卡芬太尼中的家兔进行了血浆代谢组学研究，发现受影响的主要是亚油酸、花生四烯酸和谷胱甘肽代谢途径。AMANTE 等[39]采用基于超高效液相色谱和亲水作用色谱结合四极杆飞行时间质谱（quadrupole time of flight，QTOF）技术的尿液代谢组学对芬太尼和其他阿片类药物滥用者进行区分，最终形成的单例类区分模型灵敏度和特异性分别为96%和74%。

合成大麻素精神活性物质最初是以药用目的合成的，与大麻素受体CB1 和（或）CB2 的结合亲和力比大麻的主要成分Δ9-四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）还强。2006 年以来，合成大麻素的滥用现象不断发生，各种大麻衍生物广泛分布。ZAITSU等[40]开发了一种基于气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）的代谢组学技术，研究合成大麻素MAM-2201 对大鼠脑代谢的影响，结果表明，合成大麻素MAM-2201 不仅能破坏谷氨酸能神经递质，还能破坏大鼠大脑的能量代谢；并且发现MAM-2201 在5 mg/kg 剂量下引起呼吸迟缓和运动功能减退，而在15 mg/kg 剂量下观察到更多的旋转和癫痫样行为等异常症状，提示MAM-2201 诱导神经功能紊乱。MARKIN 等[41]发现，5F-APINAC 短期和长期暴露诱导的代谢组学改变与GABA/谷氨酸、多巴胺能/肾上腺素能、胆碱能神经递质系统和犬尿氨酸途径有关，10 μmoL 5FAPINAC 慢性暴露具有胚胎毒性。

除应用代谢组学技术研究滥用药物的毒性作用机制之外，也有学者提出了用代谢组学方法预测新精神活性物质的药理学特征。OLESTI 等[42]创建了一种机器学习算法，并利用大鼠中单胺神经递质和类固醇激素的定量成功预测了甲氧麻黄酮和JWH-018 的药理学特征。

2 运用代谢组学研究滥用药物成瘾及戒断机制

滥用药物成瘾是严重的公共健康问题，但由于成瘾机制的复杂性，对于其形成机制仍未十分明确。而代谢组学在滥用物质成瘾机制研究的成功应用，表明其在药物滥用导致的身体依赖形成和戒断效应的关键影响因素等方面，有望提供新的见解。

条件性位置偏爱模型（conditioned place preference，CPP）是目前评价药物精神依赖性的经典实验模型，可以使动物在环境刺激与药物之间建立联系，形成操作性行为，从而可以通过观察动物对环境的偏爱程度来测定药物的强化效应[43]。为了研究吗啡滥用成瘾的分子机制，MENG 等[44]运用CPP 和气相色谱-质谱联用技术研究了吗啡对小鼠大脑代谢产物的影响，结果发现，吗啡诱导的CPP 模型小鼠大脑中肌醇及其磷酸盐等水平增加，肌醇被认为是星形胶质细胞活动的标志，在调节星形胶质细胞的胞内渗透压方面发挥重要作用。因此，吗啡滥用对大脑的影响主要与星形胶质细胞形态改变相关。

同时，由于药物滥用，通常涉及多种药物的联合使用。因此LI 等[45]开发了2 种CPP 模型，探索了可卡因与尼古丁联合用药对小鼠中枢神经系统的影响，结果发现，尼古丁预处理能显著增加可卡因诱导的CPP，其诱导效果与使用高剂量可卡因产生的效果相似；尼古丁对可卡因行为反应的增强作用可能归因于伏隔核和纹状体中某些特定代谢物的修饰，从而为增强可卡因的奖赏效应创造了有利的代谢环境。除此之外，性别也是一个基本的生物变量，由其所引起的行为反应或代谢物差异不容忽视。GUO 等[46]发现，雌性大鼠对氯胺酮诱导的CPP 的敏感性高于雄性大鼠，不同性别的大鼠尿液中代谢轨迹和代谢物含量的波动范围也不同。这提示我们，在戒断治疗中，性别差异的影响也不容忽视。

研究[47]发现，反复滥用可卡因或甲基苯丙胺会导致严重的心理依赖，但一般不表现出强烈的身体依赖。大鼠伏隔核和纹状体是大脑报偿回路的2 个关键组成部分，大量证据表明，这两个区域蛋白表达水平的变化与可卡因相关。反复给予可卡因之后，大鼠的伏隔核和纹状体中的神经递质谷氨酸和GABA 均增加，抑制性神经递质的增加可能与其麻醉作用相关；且反复给药导致与神经递质紊乱、氧化应激、线粒体失调和膜破坏相关的代谢物显著改变[48]。BU 等[49]发现，甲基苯丙胺重复给药亦会导致大鼠大脑不同区域展现出不同的变化模式，结果显示，反复给予甲基苯丙胺会引起神经递质紊乱、氧化应激和抗氧化剂之间的失衡，以及海马、伏隔核和前额叶皮层的神经胶质增生。LIN 等[50]则认为磷脂映射为甲基苯丙胺成瘾机制的阐释提供新见解。头发代谢组学分析表明，重度甲基苯丙胺滥用者脂类的生物合成或代谢、氨基酸的代谢受到严重影响，证明头发作为药物成瘾诊断的重要价值[51]。

可卡因与甲基苯丙胺的成瘾均与神经递质紊乱和氧化应激相关，且均观察到半胱氨酸、牛磺酸和N-乙酰天门冬氨酸（N-acetylaspartate，NAA）含量的变化[48-49]。半胱氨酸是体内形成牛磺酸的前体；牛磺酸被认为是一种神经保护化学物质[52]，其作用包括钙调节、凋亡抑制和抗氧化特性[53]。此外，牛磺酸可以防止乙醇诱导的伏隔核中多巴胺的释放，这与可卡因诱导的啮齿动物成瘾密切相关。而NAA 是神经元完整性和密度的标志。研究[54]表明，NAA 是在线粒体内合成的，而NAA 的减少与三磷酸腺苷的减少有关。因此，NAA 可以作为神经元活力的标记物和评价药物引起的氧化损伤的可靠候选[55]。因此，可卡因与甲基苯丙胺的滥用成瘾可能与半胱氨酸、牛磺酸和NAA含量变化有关。

滥用药物的滥用可能会导致心理和生理上的依赖，形成依赖后的戒断会表现出严重的戒断症状[12]。上述研究虽对成瘾机制进行了研究，但并未涉及戒断后能否恢复到正常状态。有研究[55]显示，海洛因的戒断比吗啡更严重。因此，ZHENG 等[7]对暴露于海洛因环境下大鼠的血清和尿液中代谢物进行了分析，代谢组学数据显示，海洛因给药引起代谢模式的偏差，而戒断使代谢模式恢复到基线，再次给药导致代谢模式再次偏离。对代谢物的分析表明，海洛因主要影响了三羧酸循环、游离脂肪酸代谢以及中枢神经系统[56]。这与NING 等[57]的分析海洛因戒断后再给药时的代谢特征结果相一致。除此之外，ZHENG 等[7]对甲基苯丙胺戒断后的大鼠血清与尿液进行了代谢组学研究，发现甲基苯丙胺戒除2 d 后，大部分代谢物都恢复到了基线水平。戒断之后，代谢模式恢复到正常水平，说明滥用药物成瘾并未对机体造成不可逆转的伤害。

3 运用代谢组学研究与物质滥用相关的生物标志物

生物标志物是指可以诊断系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的生化指标，具有非常广泛的用途，可用于疾病诊断、疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。同时，生物标志物可作为药物滥用者药物滥用的直接证据。

阿片类物质（海洛因和吗啡最常见）产生的依赖性强、社会危害大，因此控制其滥用是亟待解决的问题。虽然体内检出海洛因和吗啡及其代谢物是该毒品滥用的确切证据，但是在体内的半衰期较短，如海洛因（血浆半衰期2～4 min）、O6-单乙酰吗啡（血浆半衰期6～25 min）以及吗啡（血浆半衰期2.5～3 h），因此鉴定阿片类物质内源性代谢标志物是确定其滥用的重要方法之一[58]。为了研究与海洛因成瘾相关的生物标志物，吴明健等[59-60]运用液相色谱联合离子阱－飞行时间质谱（liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry，LC/MS-IT-TOF）分析方法研究了海洛因成瘾组和正常对照组之间的血清和尿液代谢差异，发现两组大鼠在血清代谢水平上具有明显差异，海洛因成瘾者和正常人聚类明显区分，筛选出12 种可能的潜在标志物。DINIS-OLIVEIRA等[61]认为，L-色氨酸、5-羟色胺和5-羟基吲哚乙酸酯被认为是海洛因长期滥用成瘾的潜在非特异性生物标志物。GHANBARI 等[62]则采用代谢组学方法成功区分了阿片类药物使用障碍（opioid use disorder，OUD）阳性（n=138）和阴性（n=80）的鸦片使用者（每周至少使用2.4 g 鸦片）。超出检测时限的成瘾组与正常组仍可很好地区分，这为代谢组学的应用提供了一种新思路。上述研究表明，基于生物体液的分析数据可以客观地判断药物滥用，而无需直接检出药物本身。但由于代谢组学很容易受到饮食、药物史和昼夜节律等外部刺激的影响，因此运用生物标志物进行药物滥用判断，还存在一些困难。

4 展 望

本文总结了代谢组学在滥用物质的应用研究进展，滥用物质的毒性作用多与能量代谢破坏、神经递质紊乱相关，此外，可卡因、甲基苯丙胺、氯胺酮还涉及氨基酸紊乱，可卡因和甲基苯丙胺滥用与氧化应激也有关。目前，对于吗啡、海洛因、可卡因、甲基苯丙胺的代谢组学研究比较多，不仅涉及生物标志物的发现以及戒断后能否恢复正常状态，同时也包括毒性作用机制的研究。但对于新精神活性物质的代谢组学研究刚刚起步，随着新精神活性物质不断涌现，以及国家打击毒品滥用力度的加大，未来新精神活性物质的代谢组学研究将会是滥用物质研究中的热点。