退变髓核细胞修复及组织工程应用研究进展

陈中，郑阳，张信成，仇湘中，许辉

(1.湖南中医药大学研究生院，长沙 410208； 2.湖南省中医药研究院附属医院骨伤科，长沙 410006)

腰腿痛是由椎间盘退变(intervertebral disc dege-neration，IDD)髓核突出压迫或刺激周围神经引起的一种常见症状。随着我国人口老龄化的加快，IDD的发病率也逐渐升高，腰腿痛已严重影响人们的生活质量，造成致残率升高和医疗成本增加[1]。髓核细胞来源于脊索细胞，在正常椎间盘与退变椎间盘内，水、纤维胶原蛋白和蛋白聚糖水平因个体和年龄等因素而存在差异，髓核内蛋白聚糖和水的含量最高，纤维胶原蛋白含量最低[2]。髓核细胞不可再生且具有重要功能，因此预防甚至逆转髓核细胞退变显得尤为重要。目前，针对IDD临床主要通过外科手术减压缓解临床症状，虽然手术治疗可取得良好疗效，但会给患者带来更大的身体创伤和经济负担，且手术治疗无法逆转退变椎间盘的病理状态，使其丧失自我修复机会，同时手术干预还会破坏椎体正常生物力学结构，导致邻近节段IDD，这也是手术治疗高复发率的原因之一[3]。随着对髓核细胞退变机制研究的深入以及生物材料的不断发展，应用细胞技术和组织工程等方法修复退变髓核细胞越来越受到关注。现就退变髓核细胞修复及组织工程应用的研究进展予以综述。

1 退变髓核组织的修复

目前髓核细胞退变的机制尚未完全阐明，Notch信号通路可能在髓核细胞退变过程中发挥重要作用，且可能与核因子κB、促分裂原活化的蛋白激酶、Wnt等经典信号通路中的一个或两个以上信号通路相互拮抗或协同作用。细胞实验表明，在培养退变髓核细胞中加入部分生长因子或抑制因子可促进退变髓核细胞的修复并可抑制其退变进程[4]。

1.1信号通路对髓核细胞的调控作用 Notch信号通路受体可直接将接收到的邻近细胞组织信号传递至细胞核，并与转录因子结合激活Notch信号通路。有研究显示，髓核内长期存在一个缺氧环境，缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α和HIF-2α在髓核细胞中稳定表达，髓核细胞已适应这种缺氧环境，当髓核内氧分压低于5%时，细胞存活率最大[5]。Hirose等[6]研究发现，抑制髓核内HIF-1的表达可间接抑制HES(hairy enhancer of split)/HEY(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif family members)样转录因子和Notch信号通路转导的激活因子JAG1(Jagged 1)等参与髓核细胞信息交换的细胞外基质蛋白的表达。曹光彪等[7]通过检测小鼠椎间盘中的Notch信号表达水平，筛选出DLL-1(一种人源重组蛋白)和JAG1表达变化最显著的信号分子，而DLL-1、JAG1对软骨细胞分化起负性调节作用。提示Notch信号通路可通过调控脊柱软骨终板中软骨细胞的增殖、分化修复退变的椎间盘。目前国内尚无相关Notch信号在髓核细胞退变中的作用机制研究，但何坤[8]用γ-分泌酶抑制剂阻滞星形胶质细胞Notch信号后发现，白细胞介素(interleukin，IL)-1β、胶质纤维酸性蛋白、血管内皮生长因子的表达均受到抑制，进而影响细胞的增殖、凋亡。潘东晟等[9]研究发现，miR-21可激活退变髓核细胞中沉默的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因，促进磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)磷酸化，从而抑制退变的髓核细胞自噬。张晗祥等[10]利用病毒转染人体退变髓核细胞中的基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，结果发现，退变髓核细胞可分泌SDF-1，且血管内皮细胞的活性和增殖水平均与SDF-1呈正相关；IDD时，髓核细胞内的聚集蛋白聚糖减少，促进血管和神经纤维长入髓核引起盘源性腰痛，但随着髓核细胞退变程度的增加SDF-1水平也逐渐升高，更有利于血管、神经的生长，如此形成恶性循环。陈江等[11]用身痛逐瘀汤含药血清干预静水压力建造退变髓核细胞模型，结果发现身痛逐瘀汤可上调磷酸化Akt的表达，抑制胱天蛋白酶-9、糖原合成酶激酶3β蛋白表达。提示身痛逐瘀汤可通过抑制PI3K/Akt信号通路中促凋亡因子的活化转录延缓人体髓核细胞退变。

以上研究表明，Notch通路通过调节细胞因子的表达延缓髓核细胞退变、改善营养途径，从而补充髓核细胞数量。Notch2受体在老年段髓核组织中的表达显著高于中年龄段的髓核组织[7]，也提示该信号通路可能尝试自我修复。因此，可通过干预Notch通路、改善髓核细胞营养促进髓核细胞的增殖、分化。

1.2生长因子对髓核细胞的修复作用 各种合成代谢生长因子和细胞因子均可改变椎间盘内平衡，刺激细胞外基质的合成。成骨蛋白1(osteogenicptotein 1，OP-1)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)均可促进髓核细胞蛋白聚糖代谢[12-13]。Liu等[14]向兔椎间盘内注射OP-1后发现，OP-1可促进髓核细胞蛋白聚糖和胶原蛋白的分泌。Takegami等[15]用软骨素诱导兔体外髓核细胞退变，将OP-1加入兔退变髓核细胞培养基中发现，兔髓核细胞蛋白聚糖可快速恢复至诱导前水平，且经OP-1干预的正常兔髓核细胞蛋白聚糖表达增加。以上研究证实，OP-1可拮抗软骨素诱导的兔髓核细胞分解代谢，同时OP-1也可促进正常髓核细胞蛋白聚糖表达。

BMP家族和TGF-β超家族主要干预细胞增殖、分化进程。研究发现，将TGF-β与生长分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF5)联合作用于髓核工程样细胞，可促进丰富的聚集蛋白聚糖和富含Ⅱ型胶原的细胞外基质分泌，且髓核工程样细胞中的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原水平与正常髓核细胞相当[16-17]。张象[18]研究发现，BMP-9可通过抑制髓核细胞Notch信号通路受体Notch1和配体DLL-1的表达，导致NICD-1(Notch1的活性分子)的表达减少，下调靶基因HES1和HES5表达，从而促进细胞外基质分泌增加。鲁花等[19]将BMP-9转染入人髓核细胞内，结果发现转染腺病毒-BMP-9患者的磷酸化Akt和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的表达均显著高于正常对照者，而正常对照者的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6和IL-8水平均显著降低。还有研究证实，TGF-β3与BMP-2可协同诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化[20-21]。TGF-β3与BMP-2联合可显著促进BMP受体2的表达，同时TGF-β与BMP还可通过磷酸化分别激活Smad2/3和Smad1/5/8信号通路，此外，TGF-β与BMP协同还可同时激活Smad4[22]。

生长因子是促进髓核细胞自我修复的重要组成部分，其生物效应与不同细胞类型、生物环境密切相关，如TGF-β作用于髓核细胞和髓核间充质干细胞发挥不同的生物效应。虽然OP-1、BMP-2、BMP-9、TGF-β等生长因子可通过Notch、PI3K/Akt、Smad信号通路调控髓核细胞细胞外基质的分泌和细胞的增殖凋亡、促进髓核细胞的修复，但仍存在效率低、分化不稳定等问题，因此生长因子与髓核细胞间的复杂作用仍需进一步探究。

1.3抑制因子对髓核细胞的修复作用 某些不包含合成代谢抑制的药剂正在被用于退变椎间盘的修复。胡凯[23]使用干扰小RNA沉默人体外髓核细胞去整合素-金属蛋白酶5的表达，然后用环形针穿刺造模，8周后发现正常髓核细胞髓核组织完全消失，而被去整合素-金属蛋白酶5沉默的髓核细胞则保持原有结构。此外，将IL-1受体拮抗剂作用于体外退变、突出的人椎间盘组织，可导致基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-3的表达降低[24]。经IL-1受体拮抗剂预处理和IL-1处理的退变人髓核细胞中的去整合素-金属蛋白酶4和MMP-3的表达水平均降低[25]。此外，在人体椎间盘中，溶解性的TNF受体与IL-1α可协同上调蛋白聚糖的合成，但溶解性的TNF受体与TNF-α共处理会抑制一氧化氮和IL-6的产生，虽然显性抑制TNF并不会激活TNF受体，但其可与TNF有效竞争，当显性抑制TNF与椎间盘细胞的IL-β拮抗时，显性抑制TNF可下调TNF-α、MMP-3、胱天蛋白酶3、前列腺素E2的表达[26-27]。目前TNF抑制剂已用于临床坐骨神经痛的治疗，但受样本量的影响，其有效性尚待验证[28]。p38促分裂原活化的蛋白激酶抑制因子可抑制MMP-3、IL-1的表达并可作为核因子κB的一种诱导剂，将p38促分裂原活化的蛋白激酶抑制因子应用于椎间盘突出模型大鼠可减轻大鼠疼痛[29]。虽然大量抑制因子对椎间盘和周围组织的影响已被广泛研究，但受伦理学和安全性的限制，其长期效应问题仍未解决。随着未来对髓核细胞自噬研究的不断深入，调节髓核细胞自噬可能成为延缓或逆转IDD过程的有效方法。

2 组织工程在髓核组织修复中的应用

髓核组织的组织工程与其他组织一样，需要细胞、载体组织、生长因子或生物信号的复合体，具体选择则需要依赖于所要修复的组织。由于椎间盘组织始终处于压力状态，修复或置换后的组织也需接受机械应力或信号。与修复纤维环相比，应用组织工程修复髓核组织更值得关注，其原因主要在于髓核组织结构较简单，且髓核退变发生较早，早期干预对延缓IDD意义重大。

2.1自体细胞移植研究 细胞移植治疗髓核细胞退变具有巨大潜力和可行性。Meisel等[30]研究发现，将自体软骨细胞经12周体外培养移植到椎间盘切除节段，结果发现移植的椎间盘软骨细胞产生的细胞外基质蛋白聚糖含量经番红O-快速绿染色技术检验与正常椎间盘组织相似，免疫组织化学也证实，在再生的椎间盘基质中存在Ⅱ型和Ⅰ型胶原，且含量均高于正常椎间盘组织；此外，经移植处理的椎间盘与周围组织整合良好，同时患者疼痛程度显著减轻。Nishimura和Mochida[31]将自体髓核细胞经体外传代后注入退变椎间盘中，结果发现自体髓核细胞再注入可促进椎间盘内蛋白聚糖、胶原蛋白的合成，同时可维持椎间盘高度，延缓IDD进程。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类具有强大增殖能力的干细胞，与其他干细胞相比更易获得，在体外培养12代后仍具有正常体型组和酶活性，且不会自动分化[32]。张宁峰等[33]证实，采用BMSCs培养基培养退变髓核细胞可恢复其活性，并促进蛋白聚糖信使RNA和蛋白以及MMP-3信使RNA和蛋白的表达。白亦光等[32]采用体外分离法培养髓核细胞和BMSCs，并用穿刺抽吸法建立兔IDD模型，造模同时行细胞移植治疗，然后将36只5月龄日本大耳白兔随机分为正常对照组、髓核细胞移植组、BMSCs移植组，结果发现 BMSCs移植组和髓核细胞移植组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖信使RNA相对表达水平均显著高于正常对照组，而正常对照组、髓核细胞移植组和BMSCs移植组比较差异则无统计学意义。还有研究分别将胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子、TGF-β加入BMSCs和髓核细胞培养基中，结果发现IGF-1和TGF-β可抑制髓核细胞MMP-2的表达、减少细胞外基质吸收，且两者具有协同作用；同时，IGF-1和BMP-7还可促进BMSCs向软骨细胞分泌，增加髓核细胞和蛋白聚糖的表达，有利于恢复椎间盘高度，而碱性成纤维细胞生长因子则可促进BMSCs增殖[34-37]。TGF-β、碱性成纤维细胞生长因子和IGF-1等细胞因子不仅可促进细胞外基质的表达，还可促进微血管的生长[38-39]，但其远期疗效仍有待研究验证。

细胞移植有助于延缓甚至逆转髓核细胞退变进程，但高成本、高难度以及椎间盘无血供、免疫保护环境等因素仍限制了其发展。虽然采用转基因细胞定向分化已取得一定成果，但转基因定向表达、转染病毒的免疫性以及转染方法等问题尚未达成共识。

2.2细胞支架生物复合材料研究 采用合适的细胞支架生物复合材料不仅有利于细胞的生长、增殖，还能减少细胞移植过程中的细胞流失。有研究显示，良好的细胞支架复合材料不仅要与周围邻近椎体快速整合，还能恢复椎间盘正常高度、延缓椎间盘退变[40]。目前研究较多的细胞支架材料主要包括：①生物活性和相容性类似于髓核细胞外基质的天然材料，如藻酸盐类、琼脂糖、胶原蛋白、硫酸软骨素等，此类材料具有与邻近椎体快速整合、细胞生长繁殖快等优点[41]，但生物力学效应差，不具备髓核的力学性能；②人工复合材料，如聚乳酸、聚羟基乙酸、共聚物和纳米纤维复合材料等，这类材料力学特性较好，甚至优于髓核细胞，但其生物毒性对细胞生长、增殖的影响难以控制。王瑾等[42]采用不同胶原支架研究BMSCs的分化，结果发现Ⅰ型胶原、Ⅰ/Ⅱ型混合胶原、Ⅱ型胶原支架均可促进髓核间充质干细胞分化，其中Ⅱ型胶原支架促进髓核间充质干细胞向髓核细胞分化的能力更强。杨斐[43]以寡肽[Nap-F-F-Y(P)]为基本单位组装成胶并复合硫酸软骨素制成的超分子水凝胶在微观结构上与细胞外基质近似，具有良好的黏弹性且生物相容度高，但这类材料对细胞生长扩增的影响还有待研究。夏金健[44]将聚己内酯与聚乳酸-聚乙醇酸共聚物按不同比例混合作为细胞支架材料，结果发现，与单纯使用某一类材料相比，混合材料在改善细胞增殖能力、活性以及细胞外基质分泌方面更具优势。综上，Ⅱ型胶原是髓核组织工程学用于细胞增殖的理想材料，未来可考虑将力学结构良好的人工材料与Ⅱ型胶原按比例复合，制造出生物性质与椎间盘髓核组织更相似的复合材料。

3 小 结

目前关于退变髓核细胞修复机制的研究虽已取得一定进展，但确切的髓核细胞退变机制仍有待进一步阐明。虽然退变髓核组织工程已广泛应用于临床，但仍有许多问题需要解决：①植入细胞、组织及整体椎间盘最佳治疗方案尚未达成共识；②生物再生治疗受患者病程的影响较大；③腰背痛的发病机制尚不明确；④促进生物修复和椎间盘置换以及术后康复的最佳治疗方案目前尚未明确。未来的研究应着重于细胞支架复合材料、细胞移植来源、基因编程等不同方法的交叉互补，实现退变髓核细胞的生物学再生，为腰椎间盘突出患者提供最佳治疗方案。