还原响应性肝靶向聚合物胶束的制备及其载药性能

2022-11-26冯荟如刘艳勤于香香

功能高分子学报 2022年6期

冯荟如，刘艳勤，董营，于香香，巩凯

（江南大学生命科学与健康工程学院, 江苏无锡 214122）

原发性肝癌，是全球癌症相关死亡的第二大原因，肝细胞癌是其主要类型[1]。由于肝癌的潜伏期较长，并且大多数患者被发现时已经处于晚期或者中晚期，这给肝癌的治疗带来了极大挑战。通常情况下，化疗成为了必然选项[2]。然而，化疗药物常常在杀死肿瘤细胞的同时损害健康细胞，产生很大的毒副作用[3,4]。因此，肝癌靶向与个性化治疗极具研究意义。肝癌组织细胞中含有丰富的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），而它在正常组织中表达较少，根据这一特性，可目标导向地设计肝靶向药物递送系统[5,6]。其中，半乳糖是良好的肝靶向分子，可作为靶向头功能化修饰药物递送系统，有效地与肝癌细胞上的受体进行特异性结合，进而实现对肝癌的靶向治疗。

近年来，纳米药物递送系统成为研究热点，尤其是在癌症诊断和治疗领域展现出巨大的应用潜力和前景[7]。纳米药物递送系统有纳米脂质体、纳米聚合胶束、纳米微球等，有效地改善了难溶性药物的溶解性、稳定性和生物利用度等性能[8,9]。然而，对于肿瘤的治疗，纳米药物递送系统仍有巨大的改进空间。肿瘤组织通常表现出弱酸性、强还原性、酶过度表达等特征[10,11]，基于这一特性，可设计微环境响应性的智能纳米药物递送系统，以期实现药物可控释放的目的，进一步提升抗肿瘤药物的治疗效果和降低化疗副作用[12,13]。聚合物胶束粒径小且分布窄，不易被网状内皮系统吞噬，且能够透过血管选择性蓄积在肿瘤组织部位，起到被动靶向的作用[14]。因此，聚合物胶束作为药物传递载体，在肿瘤的治疗方面前景广阔[15]。

本文旨在构建一种还原敏感型肝靶向聚合物胶束。首先以半乳糖为靶向分子，制备了主体分子半乳糖-β-环糊精（Gal7-CD）；然后以胱胺二盐酸盐、十八烷酸、金刚烷甲酸、双端氨基聚乙二醇等为原料，设计合成了客体分子金刚烷基聚乙二醇胺十八酰胺（Ad-PEG1000-SS-C18）；最后Gal7-CD与Ad-PEG1000-SS-C18经主客体自组装形成了两亲性聚合物，进而制备了具有还原敏感性的肝靶向聚合物胶束半乳糖-胱胺-十八酰胺（Gal7-SSC18）。在此基础上，以阿霉素（DOX）为模型药物，系统研究了载药聚合物胶束Gal7-SS-C18-DOX的载药性能与体外释放行为；同时以肝癌细胞（HepG2）和正常组织细胞（HEK-293）为细胞模型，深入探讨了聚合物胶束的细胞毒性、载药聚合物胶束对HepG2的抑制性能和细胞摄取机制。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

双端氨基聚乙二醇（NH2-PEG-NH2，Mn=1 000）、十八烷酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；七（6-叠氮-6-脱氧）-β-环糊精、3-炔基丁基-β-D-半乳糖苷、金刚烷甲酸活性酯、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、N, N-二异丙基乙胺（DIEA）、胱胺二盐酸盐、二硫苏糖醇（DTT）、N, N-二甲基甲酰胺（DMF）：分析纯，上海毕得医药科技股份有限公司；DMEM培养基与RPMI-1640培养基（其中含体积分数10%的胎牛血清（FBS）、100 IU/mL的青霉素及100 μg/mL的链霉素）：大连美仑生物技术有限公司；MTT、双抗（青霉素-链霉素）、胰酶：美国Sigma公司；FBS：上海双洳生物科技有限公司；HepG2、HEK-293：中国科学院典型生物保藏中心细胞库。

1.2 测试与表征

采用核磁共振氢谱（1H-NMR，美国Bruker公司Avance Ⅲ 400 MHz型）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR，德国布鲁克公司TENSOR Ⅱ型）表征化合物的化学结构；用纳米粒度仪（英国马尔文仪器有限公司Zetasizer Nano ZS型）检测聚合物胶束的粒径和粒径多分散指数（PDI）；使用荧光分光光度计（日本岛津有限公司RF-6000）测定临界胶束浓度；激光扫描共聚焦显微镜（CLSM，德国Leica公司TCSSP8型）用于细胞成像。

1.3 聚合物Ad-PEG1000-SS-C18的合成

1.3.1 化合物金刚烷基聚乙二醇胺丁二酸（Ad-PEG1000-COOH）的合成将金刚烷甲酸活性酯（14 mg）溶于二氯甲烷（3 mL），将其缓慢滴加到装有NH2-PEG-NH2（150 mg）的二氯甲烷（5 mL）溶液的圆底烧瓶中，室温下反应12 h。反应结束后，经柱层析纯化得到化合物金刚烷基聚乙二醇胺（Ad-PEG1000-NH2）。在干燥的圆底烧瓶中加入化合物Ad-PEG1000-NH2（150 mg）和四氢呋喃（3 mL），向其中分别滴加丁二酸酐（15 mg）的四氢呋喃（3 mL）溶液、三乙胺（0.26 mL），于室温下反应4 h。反应结束后，用盐酸溶液（1 mol/L）调节pH至4～5，用去离子水（10 mL）洗涤，二氯甲烷（10 mL）萃取水相，合并有机相，真空浓缩得到粗产物；再经柱层析得到Ad-PEG1000-COOH，产率为70%。

1.3.2 聚合物Ad-PEG1000-SS-C18的合成首先，根据文献[16]以胱胺二盐酸盐、十八烷酸为原料，经氨基保护、酰化反应、脱保护等步骤，得到胱胺基十八酰胺（NH2-SS-SA）；然后，向干燥的圆底烧瓶中加入Ad-PEG1000-COOH（300 mg）、HBTU（114.72 mg）、DIEA（134.43 mg）和DMF（3 mL），于室温下搅拌反应30 min；然后，滴加NH2-SS-SA（156 mg）的DMF（2 mL）溶液，于室温下反应24 h；反应结束后，加入去离子水（50 mL），用二氯甲烷（50 mL）萃取2次；合并有机相，用无水硫酸钠干燥过夜；经过滤、真空浓缩得到粗产物；经柱层析纯化得到Ad-PEG1000-SS-C18，产率67%。图1所示为Ad-PEG1000-SS-C18的合成路线。

图 1 Ad-PEG1000-SS-C18的合成路线Fig. 1 Synthetic routes of Ad-PEG1000-SS-C18

1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 3.75～3.56 (m, 72 H, OCH2CH2O), 3.54 (dd,J=10.1, 5.5 Hz, 4 H, OCH2CH2NH),3.48 (t,J=6.9 Hz, 4 H, NHCH2CH2SS), 3.36 (dd,J=10.5, 5.5 Hz, 4 H, NHCH2,CH2O), 2.83 (t,J=6.0 Hz, 4 H,CH2SSCH2), 2.49 (s, 4 H, CO(CH2)2CO), 2.20 (t,J=7.5 Hz, 2 H, COCH2(CH2)16), 2.03 (s, 4 H, CCH2CH), 1.87 (d,J=2.7 Hz, 5 H, CCH2CH, CH2CHCH2), 1.77 (q,J=12.4 Hz, 6 H, CHCH2CH), 1.61 (s, 2 H，CH2CH2(CH2)14), 1.29 (s,28 H, (CH2)14), 0.91 (t,J=6.9 Hz, CH3)。

1.4 Gal7-CD的合成

向圆底烧瓶中分别加入七（6-叠氮-6-脱氧）-β-环糊精（500 mg）、3-炔基丁基-β-D-半乳糖苷（665 mg）、DMF（2.5 mL）。再称取硫酸铜（95.5 mg）、抗坏血酸钠（155.1 mg）溶于去离子水（2.5 mL）中，滴加至前述溶液中，于60 ℃下反应72 h。反应结束后，过滤除去不溶性固体，滤液经真空浓缩，残留物加去离子水复溶，用甲醇沉降后得到粗产物，经氧化铝层析柱纯化，得到Gal7-CD，收率为71%。图2为Gal7-CD的合成路线。

图 2 Gal7-CD的合成路线Fig. 2 Synthetic route of Gal7-CD

图 3 Gal7-SS-C18-DOX的制备与药物释放示意图Fig. 3 Schematic representation of formation and drug release of Gal7-SS-C18-DOX

1H-NMR (400 MHz, D2O)δ: 8.03 (s, 7 H, i), 5.19 (s, 7 H, 1), 4.66～4.55 (m, 7 H, f), 4.31 (s, 14 H, g), 4.20 (s,14 H, 6), 3.99 (s, 7 H, e), 3.94～3.51 (m, 56 H, a, b, c, d, 2, 3, 5), 3.44 (s, 7 H, 4), 2.92 (s, 14 H, h)。

1.5 聚合物胶束Gal7-SS-C18和载药聚合物胶束Gal7-SS-C18-DOX的制备与表征

采用透析法制备聚合物胶束：将Ad-PEG1000-SS-C18（19 mg）和Gal7-CD（33 mg）分别溶解于DMF（2 mL）中，在室温下搅拌4 h，然后缓慢加入去离子水（8 mL），继续搅拌24 h；然后，将反应液装入透析袋（截留分子量3 500）中，透析3 d，经0.45 μm水系膜过滤，即可得到Gal7-SS-C18溶液；透析液经冷冻干燥，得到Gal7-SS-C18粉末。

临界胶束浓度（CMC）：首先，称取Gal7-SS-C18，用去离子水配制质量浓度为1×10-4～2 mg/mL的胶束溶液；然后，避光条件下，精密称取一定量芘，加入一定量的丙酮配制浓度为6×10-5mol/L的母液；最后，取30 μL母液至棕色试剂瓶中，N2吹干丙酮，向试剂瓶中分别加入3 mL不同浓度的胶束溶液，室温条件下，避光保存过夜。分别测定载有荧光探针芘的胶束溶液的激发光谱。通过测定373 nm和384 nm处的荧光强度比值（I384/I373）确定载体的CMC。

聚合物胶束的还原响应性考察：将制备好的1 mg/mL的聚合物胶束水溶液取2 mL在PBS的还原环境下（10 mmol/L DTT）和不含DTT的环境下37 ℃温育12 h，取出混合液经振荡均匀后分别加入样品比色皿中，用纳米粒度仪测试纳米胶束的粒径。

Gal7-SS-C18-DOX制备示意图如图3所示。首先，向干燥的圆底烧瓶中加入Ad-PEG1000-SS-C18（30 mg）、Gal7-CD（52.05 mg）、DMF（6 mL），缓慢滴加脱盐DOX的DMF溶液（1 mg/mL，8 mL），室温搅拌4 h；然后，缓慢滴加去离子水（12 mL），继续搅拌24 h；然后，将反应液装入透析袋（截留分子量3 500），透析3 d得到载药聚合物胶束Gal7-SS-C18-DOX溶液；透析液经冷冻干燥，获得Gal7-SS-C18-DOX粉末。

图 4 Ad-PEG1000-SS-C18和Gal7-SS-C18的1H-NMR图谱Fig. 4 1H-NMR spectra of Ad-PEG1000-SS-C18 and Gal7-SS-C18

作为对照，采用同样的方法制备去除靶向分子半乳糖的对照组载药聚合物胶束CD-SS-C18-DOX。

载药聚合物胶束的载药量测定：采用紫外-可见分光光度计法，测量480 nm处的总DOX和游离DOX的吸光度值，计算载药聚合物胶束Gal7-SS-C18-DOX的载药量和包封率。

1.6 载药聚合物胶束的体外药物释放行为

分别精确量取2 mL负载DOX的聚合物胶束溶液（1 mg/mL）加入2个密封的透析袋（截留分子量3 500）中，分别放置于DTT浓度为0、10 mmol/L的PBS（20 mL，pH=7.4）中，每组设置3个平行实验；在37 ℃，100 r/min的摇床中振荡，分别在预定时间每次取出2 mL温育的溶液，然后添加2 mL含有相应DTT浓度的新鲜PBS溶液。利用紫外-可见分光光度计测定取样样品的紫外吸光度，计算累积释放率。

1.7 体外细胞实验

1.7.1 细胞毒性实验以HepG2和HEK-293为模型，研究了胶束的细胞毒性。首先将HepG2以每孔2.0×104个的细胞密度铺于96孔板中， HEK-293以每孔1.5×104个的细胞密度铺于96孔板中，在37 ℃、体积分数5%的CO2下培养12 h使其贴壁生长；然后加入100 μL聚合物胶束（1.25～20 μg/mL）、载药聚合物胶束（0.156～10 μg/mL）及游离DOX（0.156～10 μg/mL）来替代原培养液，同时设置阴性对照，继续孵育24 h；接下来除去培养液并加入等体积的MTT溶液，继续孵育4 h后吸出MTT溶液，每孔加入二甲基亚砜（100 μL），用酶标仪于570 nm处测定吸光度，并计算细胞存活率和半抑制浓度（IC50）。

1.7.2 细胞摄取实验将HepG2和HEK-293以每孔8×105个的细胞密度接种于6孔板中，培养24 h；然后加入2 mL含游离DOX和载药聚合物胶束溶液（DOX的质量浓度为5 μg/mL）的培养基中继续孵育1 h或4 h后，移除培养基后用PBS洗3遍；然后用胰蛋白酶消化所有细胞，离心收集细胞；最后用PBS吹散细胞，利用流式细胞仪检测细胞摄取情况。

取对数生长期的HepG2和HEK-293接种于激光共聚焦皿（（每个皿含有8×104个细胞））培养24 h；除去培养液，每孔加入2 mL游离DOX和载药胶束溶液（DOX的质量浓度为5 μg/mL）培养1、4 h后除去培养液，PBS洗涤细胞3次后加入400 μL DAPI染色30 min，PBS洗涤3次，加入400 μL多聚甲醛（4 g/mL）固定细胞20 min，用PBS洗掉表面的多聚甲醛，最后加入500 μL PBS，用CLSM进行观察。

2 结果与讨论

2.1 聚合物Ad-PEG1000-SS-C18和Gal7-SS-C18的合成与表征

图4为Ad-PEG1000-SS-C18和Gal7-SS-C18的1H-NMR谱图。由图可知，Ad-PEG1000-SS-C18的1H-NMR图谱中，化学位移0.88～0.93处的峰为十八烷基的甲基特征峰，1.77～2.03的峰为金刚烷基的氢特征峰，2.83处的峰为二硫键邻位亚甲基的特征峰；与Ad-PEG1000-SSC18相比，Gal7-SS-C18的1H-NMR图谱中不仅包含了Ad-PEG1000-SS-C18的特征峰，还出现一些新的特征峰，7.18～8.06处的峰为Gal7-CD中的三唑基团的氢特征峰，5.9处的峰为半乳糖的C2氢特征峰，4.0～6.1处的峰为环糊精和半乳糖的氢基团的氢特征峰。由此可见，Gal7-SS-C18是由Gal7-CD和Ad-PEG1000-SS-C18两部分组成。

Ad-PEG1000-SS-C18和聚合物Gal7-SS-C18的FTIR谱图如图5所示。由图可知，在Gal7-CD的FTIR谱图中，3 391 cm-1和1 045 cm-1处出现了环糊精上的羟基特征峰；Ad-PEG1000-SS-C18的FT-IR谱图中，3 300、1 632、1 542 cm-1处分别出现了NH-的伸缩振动峰、酰胺的C=O伸缩振动峰、酰胺的C-N伸缩振动峰，2 916、2 850 cm-1处出现了十八烷基的亚甲基的C-H伸缩振动峰；而Gal7-SS-C18含有Gal7-CD和Ad-PEG1000-SS-C18的所有特征峰（部分有重叠），分析表明本文成功合成了Gal7-SS-C18。

图 5 样品的FT-IR图谱Fig. 5 FT-IR spectra of samples

2.2 聚合物胶束和载药聚合物胶束的制备与表征

聚合物Gal7-SS-C18的CMC值如图6（a）所示，其CMC值为0.006 mg/mL，表明Gal7-SS-C18在较低的质量浓度下可形成胶束，且可以保持良好的稳定性，具备成为载药聚合物胶束的潜质。

图 6 (a) 聚合物胶束lg ρ与I384/I373的关系；(b) 聚合物胶束和载药聚合物胶束的粒径分布图；(c)聚合物胶束的粒径变化；(d) 载药聚合物胶束的体外药物释放曲线Fig. 6 (a) Relationship between lg ρ and I384/I373 of polymer micelles; (b) Particle size distributions of polymer micelles and drug-loaded polymer micelles; (c) Particle size changes of polymer micelles; (d) in vitro drug release profiles of drug-loaded micelles

聚合物胶束以及载药聚合物胶束的粒径如图6（b）所示。由图可知，聚合物胶束的平均粒径为（169.2±1.3）nm，PDI=0.294；载药聚合物胶束的平均粒径为（177.9±3.0）nm，PDI=0.123，DOX装入聚合物胶束的内核，致使其粒径略有增大。

聚合物胶束Gal7-SS-C18的还原响应性如图6（c）所示。由图可知，在DTT存在的情况下，聚合物胶束的粒径随时间延长而逐渐变大，12 h后，部分胶束发生分解，这说明了在DTT存在条件下，聚合物中二硫键发生断裂，致使两亲性聚合物结构分解，从而使聚合物胶束分解，证明了聚合物胶束Gal7-SS-C18具有明显的还原响应特性。

Gal7-SS-C18-DOX的体外释放性能结果表明，载药聚合物胶束Gal7-SS-C18-DOX的包封率为（71.1±0.5）%，载药量为（21.2±0.7）%。由图6（d）可知，在正常微环境体系中，Gal7-SS-C18-DOX呈缓慢释放趋势，48 h累积释放量仅为33.10%；而在还原性环境下，Gal7-SS-C18-DOX药物释放较快，在8 h时，药物释放量达到80%以上，进一步证明了载药聚合物胶束的还原响应特性。在DTT存在条件下，二硫键断裂，致使聚合物胶束分解，从而加快DOX释放与提高药物累积释放量。

2.3 细胞毒性研究

聚合物胶束的细胞毒性实验结果如图7（a）所示。当聚合物胶束质量浓度为1.25～20 μg/mL时，HepG2和HEK-293的存活率均在80%以上，这说明聚合物胶束的生物相容性良好。

载药聚合物胶束对HepG2和HEK-293体外的杀伤性能实验结果如图7（b，c）所示。由图可知，对于HEK-293来说，Gal7-SS-C18-DOX胶束、CD-SS-C18-DOX胶束和游离DOX对细胞的存活率表现出一定的浓度依赖性，Gal7-SS-C18-DOX胶束和CD-SS-C18-DOX胶束对其产生的细胞毒性无明显差异，但相比于游离DOX明显较低，其可能的原因是聚合物胶束不易穿过细胞膜被细胞摄取，或者即使被细胞摄取了，但其相对稳定，DOX未得到有效释放而降低了细胞毒性；对于HepG2来说，与游离DOX相比，Gal7-SS-C18-DOX胶束对细胞的毒性略强，IC50=（3.7±0.25）μg/mL，而对照组CD-SS-C18-DOX胶束对细胞的毒性明显较低。这是由于HepG2细胞表面的ASGPR受体会促进Gal7-SS-C18-DOX胶束的跨膜穿透，有利于细胞摄取；同时由于HepG2内的谷胱甘肽浓度较高，加快了Gal7-SS-C18-DOX胶束的分解，进而使其包载的DOX有效释放，从而杀死癌细胞。而对照组CD-SS-C18-DOX胶束不含能与ASGPR受体结合的半乳糖分子，细胞对其摄取量较低，所以其对HepG2的细胞毒性较低。

图 7 (a) 聚合物胶束对HepG2和HEK-293的体外毒性；载药聚合物胶束对(b) HepG2和(c) HEK-293的体外毒性Fig. 7 (a) in vitro toxicity of polymer micelles to HepG2 cells and HEK-293 cells; in vitro toxicity of drug-loaded polymer micelles to(b) HepG2 cells and (c) HEK-293 cells

2.4 细胞摄取研究

细胞对载药聚合物胶束和游离DOX的摄取情况如图8（a，b）所示。由图可知，两种细胞对游离DOX和Gal7-SS-C18-DOX胶束的摄取均表现出时间依赖性，在不同孵育时间，HepG2的荧光强度始终比HEK-293的荧光强。对于HepG2来说，在各个时间点，Gal7-SS-C18-DOX胶束与游离DOX相比，显示出更大的荧光峰移，荧光强度更强；而对于HEK-293来说，Gal7-SS-C18-DOX胶束与游离DOX相比，荧光强度差别不大。

载药聚合物胶束Gal7-SS-C18-DOX和游离DOX被细胞摄取的情况如图8（c，d）所示。在1 h时，HepG2中有荧光，表明有DOX进入细胞核；在4 h时，其荧光强度进一步增强，说明Gal7-SS-C18-DOX胶束进一步在细胞核聚集；然而，在HEK-293中，Gal7-SS-C18-DOX胶束没有拆解入核，仅检测到微弱的红色荧光。这是由于HepG2中，载药胶束通过ASGPR受体进入细胞，入胞更快；而在HEK-293中，红色荧光虽然有明显增加，但只有极少量与蓝色荧光重叠，这是因为只有微量的Gal7-SS-C18-DOX胶束在正常水平的GSH下拆解，DOX不能被释放入核，减少了其对正常细胞的毒性。以上结果显示载药聚合物胶束Gal7-SS-C18-DOX能较快地进入肝癌细胞的细胞核，并可控释放DOX，从而有效抑制肿瘤细胞生长。

图 8 载药聚合物胶束在(a) HepG2和(b) HEK-293的荧光强度分布图和平均荧光强度图；载药聚合物胶束在 (c) HepG2和(d) HEK-293中的共聚焦扫描显微镜图Fig. 8 Fluorescence intensity distribution and mean fluorescence intensity of drug-loaded polymer micelles in (a) HepG2 cells and (b) HEK-293 cells; CLSM images of drug-loaded polymer micelles in (c) HepG2 cells and (d) HEK-293 cells