Box-Behnken响应面法优化肝泰舒颗粒提取工艺*

赵美峰 吴琳* 宋小妹 仝敏 岳明

(1.咸阳市中心医院，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

肝脏是维持生命正常活动的一个必不可少的器官。肝脏发生病变对人体的危害性无疑是巨大的，相关资料显示[1]，慢性乙肝2005年—2014年间在某地区呈上升趋势，且出现5年一个小高峰。肝病已经成为全世界除AIDS以外最难治愈的疾病之一[2]。近年来，中医学在治疗肝纤维化、肝硬化、肝腹水等肝脏疾病的研究方面也取得了良好的发展[3-5]，大量临床成果证实中药在治疗肝病上存在多靶点、药效温和、适用广泛、疗效显著等优势。中医采用辨证施治，与西医治疗相比，采用保肝治疗，优势在于强调标本兼治，对于不同时期肝硬化患者具有不同疗效[6-10]。肝泰舒颗粒为院内验方，由茵陈、板蓝根、白芍、柴胡、茯苓、虎杖、土茯苓、五味子、当归、白花蛇舌草10味中药组成，其中君药茵陈有抗炎、抗病毒作用[11]；白芍有抗炎、保肝作用[12]；柴胡有抗病毒、保肝、调节免疫等作用[13]；五味子有显著的保肝降酶作用[14]；虎杖有保护肝细胞、抗肝纤维化及抗肝癌作用[15]。全方共奏益气健脾、柔肝疏肝、清热解毒、利水消肿之功效，可用于治疗急性传染性肝炎、慢性迁延性肝炎，慢性活动性肝炎，肝硬化及肝硬化腹水。该方自2002年批准以来，在我院已有近二十年的临床应用经验，其临床效果突出。但随着中医药发展进程不断加快，中药制药工艺及检验技术有了突飞猛进的发展，而肝泰舒颗粒未曾有过工艺及质量标准方面突破性的提升，为进一步验证产品工艺的可行性，拟开展本实验。

1 仪器与试药

1.1仪器 UV-2102C型紫外-可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；SQ8200HD型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)；HH-2型恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；GB204型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Waters e 2695高效液相色谱仪(上海硅仪生化科技有限公司)。

1.2试药 药材饮片均购自陕西兴盛德药业有限责任公司；芍药苷对照品(批号：HP2024S1，宝鸡辰光生物科技有限公司)；乙腈色谱纯；甲醇、乙醇、磷酸等为分析纯。

2 方法与结果

2.1芍药苷含量测定方法的建立

2.1.1色谱条件 色谱柱：Hypurity C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：230 nm；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(12∶88)；进样量10 μL。

2.1.2对照品溶液制备 称取干燥至恒重的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3供试品溶液制备 精密称定样品1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25 mL，称重，超声(功率240 W，频率100 Hz)20 min，放冷，称重，以稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4阴性对照溶液制备 取不含白芍药材的处方中其他药材制成的阴性样品，处理方法按供试品制备方法，即得。结果见图1。

图1 HPLC图

2.1.5标准曲线建立 精密吸取“2.1.2”项下制备好的对照品溶液，加甲醇依次稀释至浓度为0.050，0.125，0.200，0.250和0.375 mg·mL-1。在“2.1.1”项下条件测定峰面积，以芍药苷的浓度(X，mg·mL-1)与峰面积(Y)作标准曲线，得回归方程：Y=8514677.85X-464460.18，r=0.9998。芍药苷浓度在0.050～0.500 mg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.1.6精密度实验 精密量取对照品溶液，连续进针6次，每次10 μL，测定其峰面积，芍药苷的RSD值为1.16 %。结果表明该仪器精密度良好。

2.1.7稳定性实验 取一组样品溶液，分别在 0，3，6，9，12和24 h按以上色谱条件测定。结果芍药苷峰面积的RSD值为1.56 %，表明本品24 h内稳定性良好。

2.1.8重复性实验 取同一批样品，平行称取6份，分别制成供试品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪测定，结果芍药苷平均含量为7.35 mg·g-1，RSD值为1.56%，表明本方法重复性良好。

2.1.9加样回收率实验 精密称取6份已知含量的供试品液0.5 g，精确加入3.8 mg的芍药苷对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果芍药苷平均回收率为98.95 %，RSD值为2.57%，表明回收率良好。

2.2浸膏得率测定 精密量取20 mL水提液至干燥至恒重的蒸发皿内，水浴蒸干，置105℃烘箱内干燥3 h，称重，计算其浸膏得率[16]。干浸膏得率(%)=干浸膏重量(g)×水提液总体积÷提取饮片总重量(g)×量取水提液的体积×100%。

2.3单因素试验

2.3.1煎煮次数的考察 将加水量固定为10倍，煎煮60 min，分别考察煎煮1，2，3和4次干浸膏得率。结果为干浸膏的得率呈上升趋势，但煎煮4次比煎煮3次增加不明显，说明药材溶出率已基本达到饱和，结合实际提取次数确定为3次，见图2。

图2 煎煮次数的考察

2.3.2加水量的考察 将煎煮次数固定为2次，煎煮60 min，分别考察加8，10，12，14，16倍量水的提取液中干浸膏的得率。结果为干浸膏得率在加8～14倍量水区间呈上升趋势，8～12倍量水区间呈明显上升趋势，当达到14倍量水时，变化趋于平缓，因此选择14倍量水作为响应面实验设计的加水量，见图3。

图3 加水量的考察

2.3.3煎煮时间筛选 将加水量固定为10倍量，煎煮2次，考察煎煮30，60，90和120 min的水提液中干浸膏的得率。结果为干浸膏得率在煎煮90 min之前呈明显上升趋势，煎煮90 min往后，干浸膏增加量趋于平缓，因此选择90 min作为响应面实验设计的提取时间，见图4。

图4 煎煮时间的考察

2.4响应面法试验 基于单因素试验结果，选择对水提工艺影响较大的煎煮次数、加水量、煎煮时间为考察因素，并确定三个水平，以方中芍药苷的含量和干浸膏得率为指标进行综合评价[17-19](权重系数为芍药苷含量为70%，干浸膏的率为30%)，设计响应面试验并进行分析，见表1、表2、表3。

表1 因素与水平表

从方差分析表可以看出，模型P<0.0001，差异非常显著，有统计学意义，表明二次多元回归模型良好，回归方程为：

Y=0.0475+0.0206A+0.0337B+0.0219C-0.0002AC-0.0116A2-0.0164B2-0.0094C2

因素AB相互作用不显著；AC相互作用较为显著；BC相互作用显著，各因素对提取工艺影响的主次顺序为：B(加水量)>C(煎煮时间)>A(煎煮次数)。而r=0.9899，差异系数CV=4.09%，表明模型模拟程度良好，相关度良好，试验误差较小；F失拟=1.61，P=0.3198>0.05，模型失拟度不显著，可以用此模型进行分析和预测。见图5、图6、图7。

表3 方差分析表

图5 AB相互关系

图6 AC相互关系

图7 BC相互关系

综上拟合的最优水提工艺为煎煮时间95 min；加水量14倍；煎煮次数3次。

2.5验证试验 结合实际生产，确定最佳提取工艺为煎煮时间为90 min，加14倍水，煎煮3次。按照最佳工艺进行三次验证试验，结果芍药苷平均含量为0.0879%；干浸膏平均得率为34.06%。见表4。

表4 提取工艺验证结果

3 讨论

肝泰舒颗粒方中主药白芍柔肝养血、缓急止痛, 其中芍药苷具有抗肝纤维化的作用[20]，且在煎煮过程中能很好的溶出和保留，本实验拟根据芍药苷含量和水提液干浸膏得率为指标，进行综合评分，采用Box-Behnken响应面法，设计三因素三水平，拟合二次多项方程，推导最佳提取工艺参数，并通过验证试验考察肝泰舒颗粒的水提工艺的准确性，该模型预测性好，简便实用，克服正交试验只能对孤立的点进行分析的缺点[21]，优选出了肝泰舒颗粒的最佳水提工艺参数，可为该制剂的工业化大生产提供可靠方案依据。