萆薢总皂苷通过抑制软骨基质降解改善豚鼠骨关节炎的作用研究*

李强 庞仲辉 陶飞飞 徐文龙

(陕西省第四人民医院，陕西 西安 710032)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种常见于老年人的以软骨发生退行性变化为主要症状的骨科疾病[1-2]。骨关节的软骨关节由大量的软骨细胞和软骨基质构成[3]，特别是软骨基质在骨关节发挥正常功能过程中扮演重要角色，但是软骨基质包括大量高度分化的无血管组织，因而导致其自我修复能力差，一旦发生基质降解将对骨关节造成严重损伤[4-6]。

萆薢是一味传统中药，中医理论认为其具有利湿去浊和祛风通痹的作用，因而中医将其用以治疗风湿痹痛，关节不利，腰膝疼痛等疾病[7]。萆薢总皂苷是萆薢的主要成分，本研究前期研究已经在体外证实萆薢总皂苷能够促进软骨细胞增殖，同时促进软骨细胞Ⅱ型胶原的分泌[8]，但是萆薢总皂苷对OA的体内作用如何，尚未见报道，因此本研究在前期研究基础上进一步探讨萆薢总皂苷对OA的体内作用，并初步研究其发挥作用的调控因子。

1 仪器与材料

1.1仪器 FV3000激光共聚焦扫描仪(日本奥林巴斯公司)；VS120切片扫描仪(日本奥林巴斯公司)。

1.2试药 萆薢总皂苷(货号:T4S0290，纯度≥98%)、牛膝总皂苷(货号:T3912，纯度≥98%)购自陶素生化；苏木素、盐酸乙醇、伊红、乙醇、二甲苯、固绿染液、苦味酸、磷钼酸、丙酮、多聚甲醛购自西安科昊生物；Col-Ⅱ(货号:ab325436)、NELL-1抗体(货号:ab653423)(Abcam 英国)；IL-1、TNF-α和MMP-13 ELISA试剂盒购自武汉天根生物。

1.3实验动物 40只豚鼠，雄性，体重(812±65.34) g，普通清洁级，10周龄，购自西安交通大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(苏)2021-0103，动物合格证号：No00343524；饲养在陕西省第四医院实验科研中心动物实验室，所有豚鼠均按照要求规范饲养和操作。

2 方法

2.1豚鼠实验分组与给药 取实验用豚鼠，随机分为Con组、OA组、TRI组[6]和TSA[7]组，每组各10只。空白对照组给予生理盐水，治疗组给予300 mg·kg-1萆薢总皂苷(TRI)，阳性对照组给予牛膝总皂苷200 mg·kg-1(TSA)，每天腹腔注射给药1次，连续30 d。

2.2骨关节炎动物造模 将豚鼠右膝关节包裹在骨关节炎模型造模支具内，固定6 w。期间豚鼠正常饮食，保持足够活动空间，每天记录豚鼠腿肢端血液循环情况、支具固定的稳定性、豚鼠活动量等情况[5]。

2.3HE染色 软骨组织脱钙处理后石蜡包埋，切片脱蜡，苏木素染色10 min，0.7%盐酸乙醇分化5 s；PBS洗片后氨水处理再水洗，伊红染色5 min，最后水洗然后乙醇、二甲苯处理，树脂封片。

2.4番红O-固绿染色 软骨组织脱钙处理后包埋脱蜡；置于至60℃预热的固绿染液中6 min；蒸馏水急洗1次；1.2%苦味酸饱和水溶液浸泡切片10 min后，再次使用蒸馏水漂洗；置于1%磷钼酸水溶液中1 min，蒸馏水漂洗1 min；番红O染液中着色3 min；70%、95%、100%乙醇分别脱水透明2次，二甲苯透明，树脂封片。

2.5免疫荧光 软骨组织脱钙处理，用预冷的甲醇和丙酮混合液(1∶1)进行固定，然后在1%TritonX-100/PBS中透化。洗片擦干后在4℃冰箱中和Col-II(1∶1000)抗体孵育过夜。次日4%多聚甲醛固定4 h，含15%蔗糖的PBS共孵育4 h，去离子水清洗玻片，使用激光共聚焦扫描分析切片。

2.6免疫组化 软骨组织脱钙处理，依次进行石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、加NELL-1(1∶1000)一抗、加二抗、DAB显色、复染细胞核、脱水封片以及切片扫描仪扫描分析。

2.7ELISA 抽取各组豚鼠骨关节液，采用ELISA试剂盒检测骨关节液中IL-1、TNF-α和MMP-13的含量。

3 结果

3.1TRI改善OA豚鼠关节骨组织损伤 与Con相比，OA组骨关节组织排列紊乱、骨结构损伤，而TRI和TSA组豚鼠骨关节组织则排列有序，骨损伤显著缓解，且TRI治疗效果优于TSA，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 HE检测各组豚鼠关节骨组织损伤

3.2TRI抑制豚鼠关节软骨基质降解 与Con相比，OA组软骨组织显著退化，软骨基质明显发生降解，而TRI和TSA组豚鼠软骨组织退化减弱且软骨基质降解作用被抑制，且TRI抑制软骨基质降解效果优于TSA，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.3TRI促进豚鼠关节Ⅱ型胶原的表达 与Con相比，OA组Col-Ⅱ显著减少，而TRI和TSA组Col-Ⅱ表达显著增高，且TRI促表达作用强于TSA。

图2 番红-O固绿检测各组豚鼠关节软骨基质降解

3.4TRI抑制IL-1、TNF-α和MMP-13的表达 与Con相比，OA组炎性因子IL-1、TNF-α和MMP-13显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，而TRI和TSA抑制IL-1、TNF-α和MMP-13表达，且TRI抑制作用强于TSA，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3 免疫荧光检测各组豚鼠关节软骨组织Col-Ⅱ表达

图4 ELISA检测各组豚鼠关节液IL-1、TNF-α和MMP-13表达

3.5TRI促进软骨组织NELL-1的表达 与Con相比，OA组NELL-1表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，而TRI和TSA组NELL-1表达则明显增高，且TRI组表达显著高于TSA组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图5 免疫组化检测各组豚鼠关节软骨组织NELL-1表达

4 讨论

软骨组织发生退行性变化是造成OA发生的重要因素[9-11]，多发于老年人，临床症状主要表现为关节慢性疼痛，尤其是负重性疼痛[12-14]，给老年患者生活和心理带来严重的不便。但是目前针对骨关节炎的药物治疗主要是口服非甾体类抗炎药以及硫酸氨基葡萄糖，或者关节内注射玻璃酸钠，需要患者长期用药，效果不确切，胃肠道反应大，治疗效果有限[15]，因此针对OA的治疗药物研发一直是临床骨科的研究热点。

有研究表明传统中药牛膝含药关节液(主要药效成为为牛膝总皂苷)能够有效促进关节软骨细胞的增殖和胶原表达[16]，但是牛膝根部入药，采集不方便，产量较小，炮制工艺较为繁琐。传统中医除了用牛膝治疗关节疼痛外，还常用到萆薢，也取得很好的治疗效果。与牛膝相比，萆薢主要是叶部入药，采集方便，炮制简单[17]，且现代中药药理学已经证实萆薢发挥作用的主要药效成分为萆薢总皂苷[18]。

本研究发现萆薢总皂苷对骨关节炎模型豚鼠具有显著的治疗作用，其缓解OA豚鼠软骨组织损伤且抑制软骨基质的降解，这对治疗OA尤为重要，同时发现萆薢总皂苷对软骨组织损伤改善和软骨基质降解抑制作用优于牛膝总皂苷，Col-II是组成软骨基质的主要成分，萆薢总皂苷显著促进Col-II表达，且促进作用强于牛膝总皂苷，这为OA治疗药物研发提供一种新的药物和治疗策略。OA往往伴随着炎性反应发生，炎性因子在OA的发生过程中起到重要作用，体外研究发现萆薢总皂苷有效抑制炎性因子IL-1、TNF-α和MMP-13表达，为萆薢总皂苷的抗炎作用提供科学依据。NELL-1是一种外分泌型糖蛋白蛋白，研究表明NELL-1是一种有效的骨诱导因子，可以有效地促进骨的生长[19]。有文献报道NELL-1能够显著改善和减轻OA中软骨细胞的凋亡[20]，因此实验中采用免疫组化观察萆薢总皂苷给药后NELL-1的表达，结果发现萆薢总皂苷和牛膝总皂苷均可显著促进NELL-1的表达，但是萆薢总皂苷给药组NELL-1阳性表达显著高于牛膝总皂苷给药组，这表明萆薢总皂苷很可能通过调控NELL-1发挥治疗OA的作用，为OA的发生机制和萆薢总皂苷的作用靶点提供一定理论依据。

综上所述，本研究明确萆薢总皂苷能够在体内显著改善OA发生过程中骨结构损伤，同时能够抑制软骨基质降解以及发挥抗炎作用，进一步发现萆薢总皂苷可能通过调控NELL-1分子发挥以上作用，但是具体调控途径和机制不明，因此下一步研究组将重点探讨萆薢总皂苷调控NELL-1的具体信号通路，完善萆薢总皂苷治疗OA的理论依据，同时为OA的药物治疗提供新的研究方向和治疗方法。