mPEG⁃PLA嵌段共聚物及其胶束的降解行为研究

2022-11-26吴菁菁张文明周秦鹏张新晴

中国塑料 2022年11期

吴菁菁，张文明，周秦鹏，张新晴，陆冲**

（1.华东理工大学材料科学与工程学院生态材料研究室，上海 200237；2.上海谊众药业股份有限公司，上海，201401）

0 前言

PLA由于其良好的物理和化学性能，作为1种生物可降解聚酯被广泛应用于各种生物医学领域［1］，如医疗器械、药物输送载体和再生工程支架等。PLA的降解性能对于其应用来说至关重要，其降解机理也一直都是被广泛研究的主题。PLA的降解受到自身特性和外部环境的共同影响［2］，除了分子量及分布［3］、分子结构与组成［4］、结晶度［5⁃6］以外，环境中的 pH 值［7⁃8］和改性方法［9⁃11］都是十分重要的影响因素。

Jong等［7］通过对接枝PLA的降解实验发现，PLA的水解与介质的pH值有关，并且PLA的末端羟基起到了关键作用［8］。“末端降解机理”是当样本在中性或碱性介质中时，PLA末端的羟基氧原子在介质离子的作用下亲核能力增强，进而与链末端倒数第2个羰基形成稳定六元环中间体，降解时生成丙交酯，进而水解为二聚乳酸。当介质酸性增加，质子化作用使得羟基末端基与相邻羰基间形成分子内氢桥，进而使得末端的羰基碳氧双键断裂生成乳酸单体。

PLA的改性方法对PLA的降解行为同样影响很大。PLA改性方法主要有2种：1种是物理共混，主要通过添加增塑剂或其他共混材料来改变PLA的宏观组成［12⁃14］；另一种是化学共聚，即通过分子结构设计，采用共接枝等化学方法来改变PLA的微观分子结构［11，15⁃19］。PEG是1种具有良好的亲水性的聚合物，也是1种重要的PLA改性材料［20］。Wang等［21］采用固溶法制备了一系列PLA/PEG共混物，通过降解实验发现PEG的引入有利于PLA的热降解，并且在一定程度上改变了PLA的热降解机理。由于PEG的亲水性，PEG/PLA共混物的水解性比纯PLA更快。同样，PEG也可以通过化学共聚的方式来改性PLA。PEG⁃PLA共聚物分子量较高，具有优良的力学性能［22］，在水解的过程中速度比PLA更快［23］，分子量呈双峰分布［24］。与此同时，由于亲水性的大大提高和良好的生物降解性［25⁃26］，PEG⁃PLA在生物医学领域有着良好的应用前景［27］。临床试验表明［28］，相比于溶剂型紫杉醇制剂，以PEG⁃PLA共聚物为辅料制备的紫杉醇聚合物胶束制剂具有更优越的疗效、更好的安全性及更低的致敏性。

采用聚乙二醇单甲醚与丙交酯共聚制备的mPEG⁃PLA作为1种两亲性共聚物，可以在水溶液中自组装形成结构稳定的胶束，亲水端PEG链段在水中伸展形成胶束的壳，疏水端PLA链段包裹难溶于水的紫杉醇形成胶束的核。本文研究的是mPEG⁃PLA共聚物作为药物载体的降解行为与稳定性。

1 实验部分

1.1 主要原料

mPEG2000、D，L⁃丙交酯、辛酸亚锡，纯度>95%，美国Sigma⁃Aldrich公司；

紫杉醇、无水二氯甲烷、无水乙醇，分析纯，上海泰坦科技有限公司；

1.2 主要设备及仪器

高压液相色谱仪（HPLC），Agilent126，美国安捷伦科技有限公司；

凝胶渗透色谱仪（GPC），Waters 1515，美国Wa⁃ters公司；

差示扫描量热仪（DSC），PE/DSC8500，德国珀金埃尔默仪器有限公司。

1.3 样品制备

mPEG⁃PLA共聚物制备：mPEG⁃PLA通过mPEG和D，L⁃丙交酯在异辛酸亚锡的催化下聚合得到；将15 g mPEG（分子量为2×103，7.5 mmol）加入schlenk瓶中，通入氮气排尽瓶内空气，130℃真空搅拌2 h脱除其中水分；在手套箱中加入18 g丙交酯和0.9 mL辛酸亚锡的无水二氯甲烷溶液（0.02 g/mL），用氮气吹扫，在高温高真空环境中去除二氯甲烷2 h；然后将真空密封的反应瓶置于130℃的恒温磁力搅拌器中反应15～24 h，用10倍剂量的无水乙醇回收沉淀物，用真空干燥箱干燥24 h，所得固体产物即mPEG⁃PLA共聚物，该嵌段聚合物的分子量为2 000～1 800。

mPEG⁃PLA紫杉醇载药胶束制备：mPEG⁃PLA紫杉醇载药胶束采用固体分散⁃薄膜水化法制备；将30 mg紫杉醇和150 mg mPEG⁃PLA置于圆底烧瓶中，加入5 mL无水乙醇溶解，然后45℃旋蒸去除有机溶剂，留下均匀混合的mPEG⁃PLA和紫杉醇薄膜；取下烧瓶，加入5 mL预热的PBS缓冲液，充分水化至薄膜完全溶解，得到DMs溶液；使用聚偏氯乙烯过滤器（0.22 μm）过滤形成的胶束溶液，此类制剂通常含有约16.7%的紫杉醇和83.3%的mPEG⁃PLA；在冻干机中冻干后，得到了胶束冻干粉，胶束的平均粒径在20 nm以内。

1.4 性能测试与结构表征

降解实验：将样品分组密封后，分别置于不同温度恒温恒湿箱中，在设定的时间点采集样品，采用GPC测定样品的重均分子量（Mw）和分子量分散指数（PDI）、采用HPLC测定主要降解产物（包括丙交酯和乳酸）和水分的变化，不同温度下的降解实验如表1所示；

表1 降解实验参数Tab.1 Data for degradation experiments

凝胶渗透色谱分析：称取样品约20 mg置于10 mL容量瓶中，用四氢呋喃定容作为供试品溶液，用GPC检测，实验温度25℃，溶液流速1.0 mL/min，用GPC软件计算供试品的Mw、数均分子量（Mn）及分子量分布；

丙交酯含量测定：取样品约0.15 g置于10 mL容量瓶中，加入乙腈使其溶解作为供试品溶液；精密称定丙交酯标准品20 mg，用乙腈溶解制成400 μg/mL的丙交酯储备液，分别稀释10、20、40、80倍作为对照品；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以水溶液和乙腈为流动相，检测波长为210 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，洗脱时间30 min；取供试品溶液和对照溶液各10 μL，分别注入HPLC，记录色谱图，根据标准曲线法以峰面积计算丙交酯含量；

乳酸含量测定：取样品约0.15 g置于10 mL容量瓶中，加水8.0 mL使其溶解，置于60℃水浴中1 h，冷却到室温后，定容至10 mL，104r/min离心15 min后，上清液作为供试品；精密称定乳散标准品22 mg，加水溶解制成 400 μg/mL 储备液，分别稀释 10、20、50、100倍作为对照品；采用ZORBAX SB⁃Aq柱（4.6 nm×250 mm×5 μm），以1%（质量分数，下同）H3PO4水溶液和乙腈为流动相，检测波长210 nm，流速1.0 mL/min，柱温40℃，洗脱时间25 min；取供试品溶液和各对照溶液各10 μL，分别注入HPLC，记录色谱图，根据标准曲线法以峰面积计算乳酸含量；

水分测定：依照《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定法，取适量样品精密称定，再迅速转移至滴定杯中直接测定；

熔点测定：取mPEG⁃PLA 5～10 mg于铝制样品皿中，采用DSC以10℃/min升温至100℃，保温3 min后，以10℃/min降温至-30℃，在-30℃保温3 min后以10℃/min速率二次升温至100℃，记录测定值。

2 结果与讨论

2.1 外观形态变化

mPEG⁃PLA聚合物和DMs在不同温度下的形态变化如表2所示。在初始状态下，mPEG⁃PLA为淡黄色固体，而DMs则为白色冻干块。在60℃的高温降解实验中，mPEG⁃PLA和DMs的形态在短时间（5 d）内就发生了显著改变，mPEG⁃PLA变成无色半透明黏稠状物，DMs变成透明的微黄色熔融物。在4℃、长达24个月的稳定性降解实验中，mPEG⁃PLA和DMs都能保持形态的稳定性，无明显变化。在2组长达6个月的加速降解实验中，mPEG⁃PLA和DMs在25℃的环境下都能保持形态的稳定性，而在40℃下mPEG⁃PLA和DMs的形态都在1个月内发生改变，mPEG⁃PLA变成微黄色半透明半凝固物，DMs变成半透明熔融物。通过DCS表征和分析，得出mPEG⁃PLA的熔点均值约为40℃，由此可以得出mPEG⁃PLA和DMs在较低温度（4℃和25℃）下可以维持较稳定的性状，当温度超过40℃时，mPEG⁃PLA和DMs都会开始熔融，物理性状上会发生明显变化，温度越高变化越明显，并且由于胶束的粒径小，DMs的熔点应当略低于聚合物，因此DMs在40℃下的熔融程度高于mPEG⁃PLA。当环境温度为60℃时，mPEG⁃PLA和DMs都能完全熔融。

表2 样品在不同温度下的形态变化Tab.2 Morphological changes of samples at different temperature

2.2 长期稳定性实验

图1是mPEG⁃PLA聚合物和DMs在长期（24个月）低温（4℃）环境中各项数据变化情况。mPEG⁃PLA的Mw和多分散性（PDI）的变化情况如图1（a）所示，mPEG⁃PLA的Mw在前6个月略有下降，在接下来的18个月Mw变化趋势逐渐平缓；与此同时mPEG⁃PLA的PDI一直都低于1.1，数值保持在1.05到1.06之间，这表明mPEG⁃PLA在低温环境下具有较高的稳定性，即使在较长时间段内，也可以保持长链的高分子结构。图1（b）和图1（c）分别展示了4 ℃下mPEG⁃PLA和DMs中的丙交酯、乳酸和水的含量变化情况。作为聚合物分子链末端降解的2种可能产物，丙交酯和乳酸在mPEG⁃PLA和载药胶中的含量都无明显变化。与此同时，水作为聚合物降解的最终产物，含量在2种样品中也几乎保持恒定不变。由此可推测出DMs和mPEG⁃PLA的降解反应在低温下活性很低。

图1 mPEG⁃PLA和DMs在4℃下的降解Fig.1 Degradation of mPEG⁃PLA and DMs at 4℃

2.3 加速降解实验

图2（a）展示了mPEG⁃PLA在25℃和40℃下的Mw变化情况，可以观察到：在前3个月，mPEG⁃PLA的Mw相比于4℃有了明显的下降，并且40℃的折线图更陡峭。通过数据分析，可以得出：mPEG⁃PLA在40℃下的分子量损失约为20%，在25℃下则约为10%。在图2（b）中，mPEG⁃PLA的PDI在40℃下由1.05逐渐增加至1.14，在25℃下由1.05增加至1.07。由此可以证明：mPEG⁃PLA分子量下降的速率与温度的升高呈正关，mPEG⁃PLA的降解反应活性会随着温度的升高而增加。图2（c）展示了mPEG⁃PLA中的丙交酯和乳酸含量分别在25℃和40℃下的变化情况。在6个月内，mPEG⁃PLA中的丙交酯含量一直都很低（0.05%以内），不仅都没有增加，反而减少至零（未检测出）。由此可以证明：丙交酯化学性质很不稳定，极易转化成二聚乳酸进而解聚生成乳酸。与此同时，mPEG⁃PLA中的乳酸含量在两种温度环境下都有所增加，通过百分比数值的分析，可以得出：乳酸含量在40℃环境中增加了近0.8%，在25℃下增加了约0.2%。由此可以推断：mPEG⁃PLA在高温下更容易发生降解，此降解反应会伴随着乳酸的生成。

图2 mPEG⁃PLA在25℃和40℃下的降解Fig.2 Degradation of mPEG⁃PLA at 4℃ and 25℃，respectively

图3表示了mPEG⁃PLA和DMs中的水、丙交酯、乳酸分别在25℃和40℃环境中的变化情况。如图3（a）所示，无论是在25℃还是40℃下，在mPEG⁃PLA和DMs样本中，水的含量都无明显变化，通过与4℃下的数据进行比较，也没有发现较明显的差异。可以得出，虽然mPEG⁃PLA在更高温度环境下分子量降低幅度更大，但最终生成的水含量几乎无差别。因此，mPEG⁃PLA在25℃和40℃下的降解主要是以嵌段聚合物分子链的随机断裂为主，并不会产生大量的水分。图3（b）和图3（c）分别为在25℃和40℃下mPEG⁃PLA和DMs样本中的丙交酯和乳酸含量的变化情况。可以观察到无论在25℃还是40℃下，mPEG⁃PLA和DMs中的丙交酯含量在6个月内变化都很小，折线走势平坦。与此同时，在mPEG⁃PLA中，乳酸含量在0、1、3、6个月时间点的数据分别为0.005%、0.033%、0.088%、0.233%（25℃）和0.005%、0.062%、0.256%、0.781%（40℃）。在DMs中，乳酸含量在0、1、3、6个月时间点的数据分别为0.055%、0.083%、0.061%、0.060%（25℃）和 0.055%、0.118%、0.961%、4.2%（4℃）。通过数值分析可以得出，在25℃下，DMs的乳酸含量变化不大，mPEG⁃PLA的乳酸含量变化更为显著。然而在40℃下，DMs的乳酸含量显著增加，增长量为4.145%，远超过相同温度下mPEG⁃PLA的情况。由此推测，当温度在40℃时，mPEG⁃PLA会出现部分熔融，而DMs由于熔点略低会全部熔融，导致胶束原有的规则结构出现坍塌，胶束内部的磷酸盐会对降解产生催化作用。根据“末端降解机理”，在中性或碱性条件下，嵌段聚合物PLA末端的羟基氧原子与链末端倒数第2个羰基形成稳定六元环中间体，降解时生成丙交酯，进而水解为二聚乳酸，最终造成乳酸含量显著增加。

图3 mPEG⁃PLA和DMs降解产物对比Fig.3 Comparison of degradation products between mPEG⁃PLA and DMs

2.4 高温降解实验

为了更好了解mPEG⁃PLA聚合物和DMs的降解情况，本文在60℃下进行了高温降解实验，各项数据如表3所示，展示了mPEG⁃PLA的Mw和PDI的变化情况及60℃下丙交酯和乳酸含量分别在mPEG⁃PLA和DMs的变化情况。在60℃下，mPEG⁃PLA的分子量显著降低，PDI显著升高。通过数据分析，分子量在10 d内损失超过30%，PDI也从大约1.05增加到大约1.36，可以得出mPEG⁃PLA在此温度下发生了剧烈的降解反应，进一步证明了mPEG⁃PLA降解反应活性随温度的升高而增强。mPEG⁃PLA中的乳酸含量由0.005%变化为零（未检测出），丙交酯含量由0.05%变化为零（未检测出），都无明显变化，由此可以推断mPEG⁃PLA分子量的显著降低主要是因为分子链上酯键的无规则断裂，产物以多聚体居多，不遵循“末端降解机理”。而在DMs中，丙交酯和乳酸的含量都有明显的增加，在仅10 d的时间里，DMs中的乳酸含量就增长了将近4倍，由此可以推测60℃环境中，mPEG⁃PLA和DMs都发生了全部熔融，高温会加速mPEG⁃PLA和DMs的降解，但两者降解机理有所不同。mPEG⁃PLA分子量的显著降低主要是因为分子链上酯键的无规则断裂，不遵循“末端降解机理”，产物以多聚体居多，丙交酯的乳酸生成量很少。胶束由于磷酸盐的催化，遵循“末端降解机理”，发生了嵌段共聚物PLA端分子链末端的解聚，产生较多的丙交酯和乳酸。