TNF-α在食管鳞癌细胞中对PD-L1表达的影响

朱世茂,李惠武,杨银银,海妮萨依姆·图尔荪,王永晨,李 卉

(1新疆医科大学基础医学院生物化学教研室,乌鲁木齐 830011;2粤北人民医院医学研究中心;3新疆医科大学中心实验室;*通讯作者,E-mail:huihui922@126.com)

食管癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一,全球食管癌发病率和死亡率分别位居第7位和第6位[1]。目前食管癌的诊断和治疗手段虽有很大改进,但由于早期食管癌缺乏特异性症状,多数食管癌患者就诊时已经处于中晚期,且总体预后差,5年生存率仅为5%～10%[2]。随着医学研究的发展和深入,免疫疗法已成为治疗癌症的一种效策略[3]。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种多效性细胞因子,在免疫稳态、炎症和宿主防御中起核心作用。根据细胞环境,它可以诱导多种效应,如凋亡、坏死、免疫细胞激活等,在肿瘤免疫监测中具有重要意义。在肿瘤的发生发展过程中也起着重要作用,它表现出促肿瘤和抗肿瘤的双重效应[4]。程序性细胞死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)及其受体PD-1是重要免疫检查点分子,正常情况下下,PD-L1与其受体PD-1结合后可抑制T细胞的过度增殖活化,维持机体正常的免疫平衡[5]。在肿瘤细胞和肿瘤微环境中PD-L1的异常高表达可介导肿瘤免疫逃逸,与肿瘤发生发展密切相关,是抗肿瘤治疗的重要热点[6]。现有研究表明,TNF-α可在包括脊索瘤在内的多种肿瘤细胞中诱导PD-L1表达升高[7],而在食管癌中的研究却少有报道。

因此,鉴于细胞因子TNF-α在肿瘤中特殊作用,高表达的PD-L1能够介导肿瘤免疫逃逸,本文旨在研究TNF-α在食管鳞癌细胞株Eca109中能否调节PD-L1的表达,以及可能的分子调控机制,并为食管癌的干预治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

食管鳞癌细胞系Eca109细胞(细胞株购买于武汉普诺赛生命科技有限公司,本实验室培养保存),RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶细胞消化液、磷酸缓冲盐溶液购自以色列Biological Industry公司,磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂购自美国Thermo公司;BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司;兔抗人PD-L1抗体、兔抗人PKA抗体购自美国Abcam公司;兔抗人P-CREB抗体购自美国Cell Signaling Technology公司、TNF-α细胞诱导因子购自美国peprotech公司;Staurosporine抑制剂购自美国Selleck公司;反转录试剂盒和PCR试剂盒购自中国大连TaKaRa公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养及分组 人食管鳞癌细胞系Eca109复苏后接种于含10%胎牛血清和含青/链霉素双抗的RPMI1640培养基中,在37 ℃、5% CO2条件的恒温细胞培养箱中常规培养。48 h换液一次,待培养细胞贴壁70%以上时按实验需求进行细胞传代。将实验分为空白对照组、TNF-α组和TNF-α+Staurosporine组。Staurosporine是一种蛋白酶抑制剂,可抑制PKA。其中TNF-α和Staurosporine这两种物质的工作浓度均为20 ng/ml。

1.2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PD-L1 mRNA的表达 采用Trizol法提取细胞总RNA并测定RNA的纯度和浓度。按照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA,放置于-20 ℃保存。上海生工公司合成所需引物。PD-L1引物如下,F:5′-CCTACTGGCATTTGCTGAACGCAT-3′;R:5′-ACCATAGCTGATCATGCAGCGGTA-3′;以β-actin作为内参,F:5′-GAGCACAGAGCCTCGTT-3′;R:5′-GAGCGCGGCGATATCATCA-3′,PCR扩增,进行结果分析。

1.2.3 免疫荧光染色检测PD-L1的蛋白表达 取对数生长期的Eca109细胞,消化成悬液后接种于6孔板内的玻璃爬片上,待细胞贴壁后,用浓度为20 ng/ml的TNF-α诱导24 h,以未做处理的细胞作为对照组。加入磷酸缓冲盐溶液清洗并弃掉洗液,用4%多聚甲醛室温固定15 min后用磷酸缓冲盐溶液清洗3次,每次10 min。兔抗人PD-L1(1 ∶200)室温、黑色湿盒封闭1 h,然后洗涤3次,每次10 min。使用荧光二抗室温、黑色湿盒孵育1 h,然后洗涤3次,每次10 min;然后加入Hochest荧光染料进行细胞核染色。最后在激光共聚焦显微镜下进行观察并采集图片。

1.2.4 Western blot检测PD-L1、p-CREB和PKA的蛋白表达 采用RIPA裂解液充分裂解细胞进行细胞总蛋白的提取,BCA法进行总蛋白浓度的测定。将总蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳分离并转移至PVDF膜上,单克隆抗体一抗(5% BSA稀释,稀释比例1 ∶1 000),4 ℃摇床过夜。然后PBST洗去一抗,孵育二抗(5% BSA稀释,山羊抗兔1 ∶5 000,山羊抗鼠1 ∶20 000)室温1 h。洗涤之后用ECL显影试剂显色。Image J软件统计灰度值计算相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示,两组间比用独立样本t检验,多组间比用单因素方差分析。以P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF-α对Eca109细胞PD-L1 mRNA表达的影响

结果显示,使用TNF-α作用细胞24 h后,与空白对照组比较,PD-L1 mRNA表达升高(P<0.05,见图1);与TNF-α组相比,TNF-α+Staurosporine组PD-L1 mRNA水平降低(P<0.05,见图1)。

2.2 TNF-α对Eca109细胞PD-L1蛋白表达的影响

结果显示,与空白对照组比较,TNF-α组使用TNF-α作用细胞24 h后激光共聚焦镜下观察PD-L1(图中红色光点)的数量明显增多(见图2),PD-L1蛋白表达水平明显升高(P<0.05,见图3),Western blot结果与免疫荧光染色结果一致。

2.3 抑制PKA通路抑制TNF-α诱导的Eca109细胞PD-L1蛋白表达

结果显示,与空白对照组相比,TNF-α组中PD-L1的蛋白表达水平增高(P<0.05,见图4),p-CREB和PKA蛋白表达无明显差异(P>0.05,见图4);与TNF-α组比较,在联合使用TNF-α和Staurosporine后,TNFα+Staurosporine组中PD-L1、P-CREB和PKA的蛋白表达水平降低(P<0.05,见图4)。

3 讨论

食管癌是世界范围内最致命的恶性肿瘤之一。它的两种主要组织病理学分型是食管鳞状细胞癌和腺癌,这两种亚型的发病率因地理区域而异:食管鳞状细胞癌在东亚、东部和南部非洲以及南欧的患病率较高,而腺癌在北美和欧洲地区更为常见[8],全球范围内的食管鳞状细胞癌约占食管癌病例的80%以上[9]。食管癌的发病原因尚不清楚,通常认为与遗传因素、环境因素和饮食习惯等有密切关系[10],因此,在食管癌中揭示疾病的分子机制,并为食管癌的干预治疗提供理论依据尤为重要。

细胞因子对肿瘤的发生发展有不可逆的改变作用,其中TNF-α主要是由白细胞特别是巨噬细胞分泌的一种具有多种生物学效应的细胞因子[11],其已被证明可以在多种癌细胞中诱导 PD-L1的表达水平的升高,如卵巢癌、肝癌、胰腺癌等[12-14],且PD-L1的升高与癌症患者的不良预后相关。为了探究TNF-α是否能够在食管癌细胞中诱导 PD-L1的表达,本研究中利用食管鳞状细胞癌细胞株Eca109细胞为研究对象,通过PCR、Western blot和免疫荧光实验方法检测,发现单独使用TNF-α诱导Eca109细胞时可以促进PD-L1的表达升高,表明TNF-α参与PD-L1上调过程。但是TNF-α调节Eca109细胞PD-L1表达升高的途径需要进一步研究。

免疫检查点阻断治疗是目前应用最广泛的肿瘤免疫治疗方法之一。PD-L1及其受体PD-1信号通路是一个已经被用于多种癌症临床治疗的免疫检查点[15]。在多种类型的肿瘤中针对PD-L1或PD-1的肿瘤免疫治疗已被证明是有效的,具有持久、毒性较小的抗肿瘤免疫反应[6]。免疫逃逸是肿瘤的一个标志,也是影响肿瘤临床治疗效果的主要原因。肿瘤细胞可表达多种免疫抑制信号蛋白,导致免疫细胞功能障碍和凋亡,其中一个抑制分子是PD-L1[16]。在肿瘤发生时,PD-L1与PD-1结合可阻止T细胞的活化和增殖,负性调节免疫应答,导致肿瘤细胞免疫逃逸的发生,当阻断PD-L1/PD-1时可以重新激活细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。肿瘤中PD-L1的表达受不同因素的影响,主要包括信号通路、转录因子及表观遗传调控,翻译机翻译后修饰调控等[17]。有研究结果表明[18]当抑制蛋白激酶A(PKA)时,在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株中cAMP通过PKA-CREB通路诱导PD-L1表达升高的作用被逆转。本研究中Eca109细胞经诱导处理后,通过荧光定量PCR和Western blot实验方法检测结果表明,TNF-α联合Staurosporine处理Eca109细胞后可降低PD-L1 mRNA的表达,同时PD-L1、p-CREB和PKA的蛋白表达也降低,逆转了TNF-α上调PD-L1表达的作用,说明TNF-α促PD-L1的表达可能与PKA-CREB信号通路有关,但是具体的调控机制需要进一步的实验验证。

综上所述,本文研究了细胞因子TNF-α对PD-L1表达的影响以及相关途径的探讨,发现TNF-α能够促进食管鳞癌细胞Eca109细胞PD-L1的表达,而且TNF-α上调PD-L1表达作用可能与PKA-CREB信号通路有关,加深对TNF-α诱导PD-L1表达过程的理解,有助于为探寻食管癌的治疗靶点提供理论参考。