NVP-BEZ235调节肿瘤细胞DNA辐射损伤修复作用研究进展

孙婉君 张 恒 王 辉

放射治疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一，但辐射抵抗依旧是困扰肿瘤科医生的难题。在对放射生物学的探索中，Withers于1975年提出临床放射生物学中的“4R”理论，即：细胞放射损伤修复(repair)、细胞周期再分布(reassortment)、氧效应及缺氧细胞再氧合(reoxygenation)和细胞再群体化(repopulation)。在此基础上，Steel于1989年提出第5“R”，即放射敏感度(radiosensitivity)。多项研究着眼于调节以上不同途径，以期增加肿瘤细胞的辐射损伤。PI3K/Akt/mTOR通路是肿瘤发生、发展过程中的经典信号通路，经电离辐射诱导，该通路异常激活，可通过促进DNA损伤修复等机制，表达辐射抗性。NVP-BEZ235是一种PI3K、mTOR双重抑制剂，多项体外/异种移植瘤研究已证明NVP-BEZ235可特异性阻断PI3K/Akt/mTOR通路，进而调节DNA损伤修复途径，增加肿瘤细胞的辐射损伤。

一、NVP-BEZ235抑制PI3K/Akt/mTOR通路

根据放射生物学相关研究发现，治疗剂量的高能X射线通过在细胞内激发活性氧，造成对肿瘤细胞DNA的持续损伤，其中DNA双链断裂(double-strand break，DSB)是最致命的DNA损伤类型，会导致细胞凋亡、衰老或失去增殖能力[1]。细胞为保持基因组的稳定性，进化出一套有效的应激反应机制——DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)，包括细胞周期检查点阻滞和DNA损伤修复，对DSB进行有效修复，避免细胞凋亡。其中修复方式主要有两种，即非同源末端结合修复(non-homologous end-joining，NHEJ)和同源重组修复(homologous recombination，HR)，这也是目前认为导致肿瘤细胞辐射抵抗的重要原因之一[2]。

PI3K/Akt/mTOR通路在诸多基本细胞过程中起中心作用，与多条通路存在交互作用，电离辐射诱导后活化异常，多项研究证明，参与激活下游细胞周期蛋白和DNA修复途径蛋白，启动DDR途径，是肿瘤细胞表达辐射抗性的主要机制[3]。该通路活化，由雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTOR complex 1，mTORC1)介导磷酸化下游真核起始因子4E结合蛋白1[eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF-4E)-binding protein 1，4E-BP1]和核糖体蛋白质S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1)，使其分别与eIF-4E和真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIF-3)解离，促进翻译起始复合物的形成。S6K1磷酸化eIF-4B和核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6，S6)，启动翻译，并磷酸化真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF-2K)，使翻译延长。研究发现，mTORC1介导合成的蛋白主要参与调控细胞侵袭、转移、DNA 损伤修复过程[4]。因此，抑制PI3K/Akt/mTOR通路可以减少DNA损伤修复相关原料生成，间接抑制细胞的自我修复。

目前已发现多种PI3K和mTOR抑制剂，其中NVP-BEZ235是咪唑喹啉类化合物，一种强效的双泛Ⅰ类PI3K和mTOR抑制剂，通过竞争ATP结合位点，可逆地抑制PI3K Ⅰ类和mTOR复合物的催化活性[5]。较mTOR单靶点抑制剂，可消除通路内反馈机制，更有效的抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化，使4E-BP1和eIF-4E、S6K1和eIF-3维持结合状态，抑制翻译起始复合物形成，减少DNA修复过程原料蛋白的合成，以抑制DNA损伤修复，达到增加辐射损伤的结果。

二、NVP-BEZ235抑制非同源末端结合修复途径

非同源末端结合修复(NHEJ)途径是DSB的主要修复途径，由以DNA依赖性蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)为关键酶的多酶复合物执行，将断裂的DNA链末端连接在一起，可以发生在细胞周期中的所有阶段。随着生物进化复杂程度的提高，NHEJ在DDR中所占的比重逐渐增加，因此有效抑制NHEJ途径对于抑制DNA损伤修复作用至关重要[6]。

DNA-PK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，含有DSB特异性末端结合蛋白Ku(Ku70/Ku80异源二聚体)和DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)。当DSB发生时，Ku蛋白对DNA末端进行识别，将其穿入蛋白二聚体的孔中，通过Ku80羧基末端结构域将DNA-PKcs连接到Ku DNA结合结构域。DNA-PKcs在多个丝氨酸、苏氨酸位点被磷酸化激活，进一步激活Ku70、Ku80、Artemis、XRCC4、XRCC4样因子(XRCC4-like factor，XLF)和DNA连接酶Ⅳ(DNA Ligase Ⅳ，Lig4)。XRCC4和XLF具有相似的二聚体结构，在Lig4羧基端的BRCT重复序列介导下，与Lig4相互作用，将DNA片段进行连接。在NHEJ修复结束或过程中，Ku蛋白被E3连接酶RNF8泛素化降解。

有研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路中的关键蛋白Akt参与激活DNA-PKcs，进而启动NHEJ途经[7]。Akt包括Akt1(PKBα)、Akt2(PKBβ)和 Akt3(PKBγ)3个亚型，其中Akt1亚型在全身广泛表达，与辐射诱导后的DNA损伤修复相关，是肿瘤的不良预后因素[8]。经辐射诱导，异常激活的PI3K促使磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP2)磷酸化产生 PIP3，进而在Thr残基磷酸化激活Akt异构体(PKBα-Thr308、PKBβ-Thr309、PKBγ-Thr305)。雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTOR complex 2，mTORC2)在Ser残基磷酸化Akt异构体(PKBα- Ser473、PKBβ- Ser474、PKBγ- Ser472)，使Akt的活性最大化。磷酸化的Akt1促进DNA-PKcs与Ku蛋白结合以及在DNA损伤位点的积累，并使DNA-PKcs于Ser2056位点自磷酸化激活[9]。NVP-BEZ235作为一种PI3K/mTOR双重抑制剂，同时作用于PI3K和mTORC2，与单靶PI3K或mTORC1抑制剂比较，Akt的两个磷酸化位点均被有效抑制，消除相应的反馈机制，对PI3K/Akt/mTOR通路以及下游DNA-PK表现出更强的抑制效果，达到增加辐射损伤的结果。

另有研究认为，Akt与DNA-PKcs的层级关系尚存在争议，DNA-PKcs在Ser473位点磷酸化激活Akt，反之不然，但NVP-BEZ235仍对NHEJ途径表现出有效的抑制作用。Ser2056和Thr2609位点磷酸化是DNA-PKcs表达激酶活性不可缺少的条件，其中Ser2056由DNA-PKcs进行自体磷酸化，Thr2609则由共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ataxia-telangiectasia mutated，ATM)介导磷酸化[10]。DNA-PK和ATM均属于磷酸酰基醇3激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK)家族，与PI3K高度同源，为PI3K抑制剂同时抑制DNA-PK、ATM提供了生物学基础[11]。由此，NVP-BEZ235可以直接抑制DNA-PK和ATM的活性，从而抑制NHEJ途径，增加细胞辐射损伤。

三、NVP-BEZ235抑制同源重组修复(HR)途径

同源重组修复(HR)途径使用姐妹染色单体作为模板进行修复，是高度保守的DSB修复方式，发生在细胞周期中的S期和G2期。当DSB发生时，DNA损伤传感器ATM磷酸化激活，乳腺癌1型易感蛋白(breast cancer type 1 susceptibility protein，BRCA1)被ATM直接或通过检查点激酶2(checkpoint kinase 2，CHK2)间接磷酸化激活，同时也可被细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinases，CDK1)磷酸化激活。BRCA1与CtBP相互作用蛋白(CtBP-interacting protein，CtIP)结合，竞争性地从DSB位点去除p53结合蛋白1(p53-binding protein 1，53BP1)，将双链DNA切除为两条3(单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)，复制蛋白A (replication protein A，RPA)对ssDNA进行快速包被和保护。BRCA1与BRCA2伴侣及定位蛋白(partner and localizer BRCA2，PALB2)结合在DSB位点招募乳腺癌2型易感蛋白(breast cancer type 2 susceptibility protein，BRCA2)。继而将RAD51募集至ssDNA周围，去除RPA，形成均聚物纤维并连接同源染色单体。DNA聚合酶将损伤DNA的3′端拉长，然后进行DNA连接。

HR途径在哺乳动物细胞DNA损伤修复中仅占30%左右，然而一些研究认为，HR对细胞存活的意义较NHEJ更大，这可能是因为DSB更容易发生在G2期，可能是因为HR途径精确的复制方式，也可能是因为HR途径在DNA复制中的作用[12]。其中RAD51是HR途径的核心蛋白，表达量随HR途径周期性变化，在S期和G2期最高[13]。肿瘤细胞中RAD51高表达提示预后不良。在此之外，细胞复制过程中，暂时被解开的DNA双螺旋结构极易受到核溶解攻击，同样可引发DSB，RAD51在维持复制叉稳定性的过程中起到重要作用，这对肿瘤细胞的增殖至关重要[14]。

BRCA1和BRCA2突变与乳腺癌、结直肠癌等多个瘤种易感性相关，在HR途径中同样扮演重要角色[15]。研究发现，在辐射诱导下，BRCA1可以抑制细胞内活性氧的产生，减少DSB，并且具有E3连接酶活性，差异性泛素化DNA损伤修复蛋白及细胞周期相关蛋白，参与调控细胞周期。BRCA2可通过招募RAD51维持DNA复制叉稳定性，保护端粒完整性，并促进HR途径。BRCA1和BRCA2还在调控细胞自噬、基因转录、染色质重塑等方面发挥作用[16]。

多项研究在探索PI3K/Akt/mTOR通路对HR途径的调控作用[17]。目前已知，活化的Akt可上调RAD51表达，直接磷酸化BRCA1，并促进BRCA1-RAD51核定位，激活HR途径[18]。NVP-BEZ235可通过对Akt的抑制作用，抑制BRCA1活性，以及BRCA2、RAD51的补充，减少RAD51蛋白合成并损伤其核定位，并由于BRCA1的泛素化作用，间接影响CtIP、γH2AX等蛋白与DNA结合。如前文所述，ATM属于PIKK家族，NVP-BEZ235可直接抑制ATM活性，从而抑制HR途径，增加细胞辐射损伤。

四、NVP-BEZ235抑制细胞周期进程

在肿瘤细胞中，PI3K/Akt/mTOR通路异常激活造成的细胞周期检查点失控，使细胞处于持续增殖状态。当DSB发生时， ATM激活下游CHK2，然后在Ser216位点磷酸化Cdc25，这是一种蛋白磷酸酶，可以使CDK1于Tyr15位点磷酸化，抑制CDK1/Cyclin B1复合物活性，使细胞周期在G2/M检查点暂时停滞，为HR途径提供充分的作用时间[19]。待DNA损伤修复完成或耐受，CDK1的Tyr15位点去磷酸化，激活CDK1/Cyclin B1复合物活性，解除细胞周期G2期阻滞。

但研究表明，NVP-BEZ235在细胞G0/G1期表达出更明显的放射增敏效果，主要抑制NHEJ途径[20]。Cyclin D和Cyclin E为G1～S期细胞周期进程的重要调控因子，由mTOR在翻译水平上对其进行调控，其表达上调是肿瘤预后不良的标志。NVP-BEZ235通过抑制mTOR活性，下调S6K和eIF-4E磷酸化水平，减少Cyclin D和Cyclin E的表达，并通过糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β)介导，促进蛋白降解，使细胞出现G0/G1期阻滞。另外，NVP-BEZ235通过抑制Akt活性，上调下游p21表达。p21是一种周期蛋白依赖性激酶抑制剂，依赖于GSK3β/β-catenin/p21级联反应，抑制Cyclin E/Cdk2复合物活性，诱导细胞G0/G1期阻滞。

NVP-BEZ235在抑制细胞增殖能力的同时，压缩HR途径作用时间，并延长了利于增加细胞辐射损伤的细胞时相。

五、展 望

综上所述，在细胞复杂的通路网络中，存在着多重交互作用。NVP-BEZ235作为PI3K/mTOR双重抑制剂，可通过对PI3K/Akt/mTOR通路的有效抑制作用，下调NHEJ和HR途径活性，同时可由于PIKK家族内蛋白结构的相似性，直接抑制NHEJ和HR途径，增加肿瘤细胞的辐射损伤。并有研究发现，DNA损伤修复途径的选择处在动态变化之中，当其中一条DNA损伤修复途径(NHEJ/HR)被抑制时，会出现另一条途径(HR/NHEJ)的增强。NVP-BEZ235同时作用于NHEJ和HR途径中的多个蛋白靶点，效果优于mTOR、DNA-PKcs或ATM单靶点抑制剂，在增加细胞辐射损伤的探索中展现出更丰富的前景。

目前NVP-BEZ235与放射敏感性相关的研究尚停留在体外/异种移植瘤阶段，仅有数项与化疗敏感度相关研究进入Ⅰ/Ⅱ期临床研究阶段，且结果尚不理想，其体内作用机制仍需更多的研究与验证。