CRISPR-Cas技术在病毒性传染病诊断中的应用

战佳兴，文雪霞，张 莹

(沈阳农业大学动物科学与医学学院/东北畜禽疫病研究教育部重点实验室，辽宁沈阳 110161)

病毒性传染病尤其是新发和再发病毒性传染病一直是人类和动物健康的重大威胁[1]。2019年末出现的新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019，Covid-19)迅速席卷全球，严重影响人类健康和正常生活，对全球经济造成重大冲击[2]。2018年8月在我国首次暴发的非洲猪瘟(African swine fever，ASF)疫情也对生猪产业造成不可估量的损失[3]，至今，ASF仍在多个国家和地区流行，影响生猪生产和全球贸易。对病毒性传染病的及时诊断有利于控制疫情扩散，降低感染风险，保障人类和动物健康。目前，最常用的核酸检测方法是荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)[4]。该方法特异性好、灵敏度高，应用最为广泛。然而，该方法需要专业人员操作和较为昂贵的机器，且耗时相对较长，因而限制了其在现场的应用。病毒性传染病理想的诊断方法应满足以下条件：敏感、特异、快速、成本低、操作简单、不需或需要最简单的仪器。迄今为止，没有任何一种方法符合所有要求。因此，需要不断开发新的、更有效的分子诊断方法。

规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)最早由日本分子生物学家石野良纯于1987年在大肠埃希氏菌中偶然发现[5]，后来的研究发现CRISPR是广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列,为细菌和古生菌抵御病毒和质粒入侵不断进化的产物。CRISPR由众多短而保守的重复序列区(repeats)和间隔区(spacers)组成。repeats含有回文序列，可以形成发卡结构，而spacers比较特殊，是被细菌俘获的外源DNA序列。位于序列上游的前导区(leader)是CRISPR的启动子。另外，在上游还有一个多态性的家族基因Cas(CRISPR associated)，其编码的蛋白为CRISPR系统中的一类核酸酶，对CRISPR系统发挥获得性免疫功能具有重要作用[6]。不同类型的Cas蛋白在CRISPR系统适应、表达、干扰等作用阶段发挥不同的作用。Cas蛋白与CRISPR序列区域共同发生作用、共同进化，在细菌中形成CRISPR-Cas系统，该系统可作为一种适应性免疫系统使细菌免受病毒侵害。根据效应蛋白的数量将不同的CRISPR-Cas系统分为两大类，并进一步细分为6个主要类型(Ⅰ-Ⅵ型)和19个亚型[7]：第1类CRISPR系统利用多个Cas蛋白和crRNA(CRISPR-derived RNA)形成一个效应复合物[8]；第2类CRISPR系统利用一个大的单组分Cas效应蛋白与crRNA结合来发挥干扰等作用[9]。目前，基于第2类的Cas9(Ⅱ型)、Cas12(Ⅴ型)和Cas13(Ⅵ型)的CRISPR-Cas系统应用较为广泛。与传统基因编辑技术相比，它们步骤简单、操作方便、编辑效率高且耗时短，有着潜在、巨大的应用价值。论文主要阐释CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13在现有病毒性传染病诊断中的应用。

1 CRISPR-Cas技术原理

1.1 CRISPR-Cas9技术原理

Ⅱ型CRISPR-Cas系统Cas9蛋白通过crRNA和反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)靶向特定DNA位点[10]。CRISPR-Cas9系统发挥功能分为三个步骤：第一步，CRISPR-Cas9系统通过PAM(protospacer adjacent motif，序列富含G，为5′-NGG-3′)位点找到原间隔序列，并将间隔序列导入CRISPR 序列。第二步，前导区转录出由整个CRISPR序列转录而成的pre-crRNA(pre-CRISPR-derived RNA)和由重复序列区转录而成的具有发卡结构的tracrRNA。pre-crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白组装，靶向相应的间隔序列 RNA，并在核糖核酸酶(RNase)Ⅲ的协助下对这段间隔序列进行切割，最终形成一段短小的crRNA。crRNA、Cas9、tracrRNA组成的复合物即为发挥切割作用的CRISPR-Cas9系统。第三步，CRISPR-Cas9系统对DNA进行精准切割。CRISPR-Cas9从外源DNA序列中识别出与crRNA互补的原间隔序列，并定位到PAM序列区域。此时，DNA双链解开形成R-Loop结构，crRNA与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。随后，Cas9蛋白的核酸酶结构域HNH剪切与crRNA互补的DNA链，而其另一核酸酶结构域RuvC则剪切非互补链，引起DNA双链断裂(double stranded break，DSB)[11]。

后续研究发现CRISPR-Cas9系统不仅可改造病毒DNA，还可编辑所有DNA。理解该系统具体作用机制后，将crRNA和tracrRNA两种RNA融合为单一的导向RNA(single guide RNA，sgRNA)对其进行简化。CRISPR-Cas9系统一端包含需要切割的目标序列，另一端与Cas9结合。通过sgRNA识别并结合靶标序列(靶标序列周围含有PAM位点)，Cas9蛋白即可对靶标序列进行切割。因此，理论上来讲，CRISPR-Cas9系统可通过改变sgRNA序列编辑任何感兴趣的靶标序列[10]。

1.2 CRISPR-Cas12技术原理

CRISPR-Cas12包括Cas12a和Cas12b，它们识别靶序列需要依赖于富含T的PAM序列(5′-TTN-3′)，在切割目标序列后形成黏性末端[12]。CRISPR-Cas12具有双重切割活性，可切割DNA和RNA。与CRISPR-Cas9不同的是，Cas12只有一个RuvC样结构域切割DNA双链。而且，Cas12可单独对pre-crRNA进行加工，并利用加工后产生的crRNA特异性地靶向和切割DNA，因而不需宿主细胞的RNase和tracrRNA，是一种简单的CRISPR免疫系统[13]。与Cas9相比，Cas12具有分子质量小、对错配的耐受性较低等优点[14]。更为重要的是，Cas12还具有旁切活性，即靶DNA序列激活的非靶标DNA切割活性[12]。目前，发现具有旁切活性的Cas12蛋白酶包括来自毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌ND2006的LbCas12a、Acidaminococcussp.的AsCas12a、Franciellanovicida的FnCas12a和Alycyclobacillusacidoterrestri的AaCas12b[12]。

1.3 CRISPR-Cas13技术原理

CRISPR-Cas13技术特异性更强，且与前两者不同的是，该系统可识别单链RNA分子，该过程只需Cas13蛋白和crRNA分子。在结构上，Cas13蛋白与Cas9及Cas12蛋白也不同，Cas13蛋白不含有HNH或RuvC样结构域，而是具有两个高级真核生物和原核生物核苷酸结合(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding，HEPN)内切酶结构域，通过这两个结构域精确介导含有PFS(protospacer flanking sites)位点的RNA的切割[15]。在切割靶标RNA后，Cas13还可切割任意相邻的单链RNA[16]。目前已被鉴定的Cas13蛋白包括Cas13a(之前称为C2c2)、Cas13b和Cas13c[9]。

2 CRISPR-Cas技术在病毒性传染病诊断中的应用

2.1 CRISPR-Cas9技术在病毒性传染病诊断中的应用

CRISPR-Cas9技术是CRISPR-Cas系统最早受到关注的技术，广泛应用于生物医学领域。尤其在控制病毒感染方面已取得许多进展，如建立动物研究模型、动物的抗病育种等。在病毒检测方面的应用虽不如其在控制病毒感染方面广泛，但也有不少成功的尝试。寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，孕妇感染后可能引起新生儿小头症[17]。Pardee K等[18]基于toehold switch传感器采用比色法建立了在纸基无细胞系统中检测ZIKV的方法，进一步将该方法与CRISPR-Cas9技术结合，提高了检测的特异性，可区分只有单核苷酸变异的毒株。

研究人员将CRISPR-Cas9核酸内切酶特性与等温指数核酸扩增相结合，开发出一种新的检测方法，称为CRISPR-Cas9触发等温指数扩增反应(CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction，CAS-EXPAR)。该方法所需“引物”由CRISPR-Cas9特异性切割目标DNA序列产生，通过产生的引物引发扩增反应，扩增反应循环进行产生大量DNA。通过实时分析荧光强度，可在1 h内实现DNA检测。CAS-EXPAR为有效的核酸扩增提供了新的选择，并具有分子诊断应用的潜力[19]。

东南大学王进科团队将CRISPR-Cas9核酸内切酶特性与核酸扩增相结合，开发出一种称为ctPCR(CRISPR-typing PCR)的检测方法，并陆续开发出1.0[20]、2.0(又称为Cas9/sgRNAs-associated reverse PCR，CARP)[21]和3.0版本[22]。ctPCR1.0主要包括三个步骤：(1)利用通用引物扩增靶标DNA序列，以确定待检物中是否含有病毒；(2)利用Cas9酶切割(1)中PCR产物；(3)利用特异性引物对(2)中切割产物进行第2轮PCR扩增，以确定病毒的基因型或者亚型。人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)已成为全球宫颈癌的主要元凶，虽然HPV有228种基因型，但目前认为只有持续感染高危型HPV(主要是HPV16和HPV18)才会导致宫颈恶性肿瘤的发展。因此，对HPV16和HPV18检测尤为重要。该团队建立了HPV16和HPV18的ctPCR1.0检测方法，并在宫颈癌细胞和临床样本中验证它的有效性[20]。ctPCR2.0更适合在临床上使用，它首先利用Cas9酶进行酶切，其次将酶切产物连接，最后以连接产物为模板进行PCR扩增[21]。ctPCR3.0只需一步即可检测出靶标DNA，它利用qPCR扩增Cas9/sgRNA切割的DNA样本。通过将Cas9和sgRNA直接添加到qPCR反应中，并在qPCR反应程序之前添加等温孵育进行Cas9酶切，该方法可在2 h内检测完毕。同样地，该方法的有效性也已在HPV上验证[22]。

2.2 CRISPR-Cas12技术在病毒性传染病诊断中的应用

相比于CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas12技术在体外病毒核酸检测方面应用更为广泛。2018 年，Doudna等提出了DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)分子诊断平台[23]。该平台依赖于Cas12蛋白酶被靶DNA序列激活后的非特异性DNA切割活性。特异性crRNA识别靶标单链DNA序列后Cas12蛋白酶被激活，随后Cas12蛋白酶可切割DNA分子探针(与TaqMan 探针类似，一端连接荧光基团，一端连接淬灭基团)，那么可通过监测荧光信号确定有无相应病原。另外，DETECTR将CRISPR-Cas12和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)相结合，在提高检测灵敏性的同时也避免了对昂贵仪器设备的需求。DETECTR可用于区分HPV16和HPV18。针对L1基因的高变区设计crRNA(HPV16和HPV18只相差6个核苷酸)，在粗提DNA的情况下，1 h内即可完成检测[23]。

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的严重危害全球养猪业的重大疫病。该病在世界范围内广泛传播，影响生猪养殖及其全球贸易[3]。通过靶向ASFV基因组的crRNA激活Cas12a蛋白，进而使其切割DNA荧光探针，在2 h内即可检测出ASFV，且检测限可达到1 pmol/L[24]。将CRISPR-Cas12进一步与等温扩增结合，可将检测限降至100 fmol/L。该方法操作简单、方便、不需要昂贵的仪器且成本低，特别适合动物病毒核酸的检测[24]。

此外，研究人员将DETECTR分子诊断平台中的等温扩增步骤替换为PCR开发出HOLMES(one hour low-cost multipurpose highly efficient system)检测平台。利用该平台可检测DNA病毒(如伪狂犬病病毒)和RNA病毒(如日本脑炎病毒)，检测限可达10-18mol/L～10-17mol/L[25]。但是，该检测平台需要PCR仪，且耗时比较长。因而，利用环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)与Cas12b识别靶标双链DNA或者单链DNA后激活的侧切活性开发出HOLMESv2[26]。该方法利用的Cas12b来源于Alicyclobacillusacidoterrestris(AacCas12b)，它识别切割带有5′-TTN-3′PAM序列的双链后侧切活性被激活[27]。单链DNA序列激活Cas12b侧切活性不依赖于PAM序列，只要浓度合适(最低浓度大约为1 nmol/L)即可激活。Cas12b识别靶标单链DNA分子10 min后荧光值可达到高峰，识别双链DNA分子后30 min达到高峰。Cas12b和LAMP结合检测限可与Cas12a相当。HOLMESv2检测适用于RNA病毒和DNA病毒的检测。

以上的检测方法大都需要多次移液，有污染样品的风险。为解决该问题，Sun Y等开发了利用Cas12a在单管检测Covid-19病原SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)的方法OR-DETECTR[28]。该方法直接将提取的RNA加入试管底部进行RPA反应，DETECTR混合物被物理隔离在同一试管管盖内。RPA扩增后，RPA产物和Cas12a混合物通过瞬时离心混合，扩增的产物即可被Cas12a识别产生荧光信号[28]。无独有偶，另一团队也开发出一种简便检测SARS-CoV-2的方法——STOPCovid(specific high-sensitivity enzymatic reporter un-locking testing in one pot Covid)。该方法利用磁珠提取RNA，去除乙醇洗涤和洗脱的步骤，简化RNA提取过程。此外，该方法中LAMP和Cas12酶切在同一反应体系和条件下进行，由于LAMP扩增需要55 ℃～65 ℃，因此选择耐热的AaCas12b酶[29]。STOPCovid 的灵敏性约为33 RNA copies/mL，优于CDC推荐的qPCR方法[29]。

由于CRISPR-Cas系统本身不会诱发强大的、特异的与样品中靶序列相关的信号，在利用CRISPR-Cas系统检测之前通常需要对核酸进行扩增以增强检测的灵敏度和特异性。但是，也有研究人员开发出核酸扩增的替代方法。Nguyen等证明在crRNA 3′端延伸7个核苷酸可提高Cas12a检测的灵敏度，从而可在Cas12a检测之前不必进行核酸扩增，即CRISPR-ENHANCE(enhanced analysis of nucleic acids with crRNA extensions)[30]。

2.3 CRISPR-Cas13技术在病毒性传染病诊断中的应用

2017 年，Gootenberg J S等[31]依赖来自Leptotrichiawadei的Cas13蛋白核酸内切酶活性开发出SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter un-locking)分子诊断平台。与Cas12蛋白类似，Cas13蛋白识别和切割特异性RNA分子后激活其侧切活性切割RNA荧光探针。该诊断平台利用RPA技术提升核酸检测灵敏度。将目标模板经过RPA或逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse tranion-recombinasepolymerase amplication，RT-RPA)技术等温扩增，再利用T7体外转录使DNA模板转录成可被Cas13a直接结合的靶标RNA。在crRNA的引导下，Cas13a识别并结合靶标RNA，激活其侧切活性，使其切割反应体系中带有荧光基团的报告RNA分子，从而释放荧光信号，指示目标核酸的存在[32]。SHERLOCK已验证可用于ZIKV、登革热病毒(Dengue virus，DENV)的检测。SHERLOCK诊断平台的所有成分都可冻干且长期储存不影响检测的敏感性和特异性[31]。随后，该团队又利用4种不同来源的Cas13蛋白同时检测4个病原，开发出SHERLOCKv2[33]。除了SHERLOCK用到的LwaCas13a(偏好切割富含AU序列)、还有来自ApnocytophagacanimorsusCc5的CcaCas13b(偏好切割富含UC序列)、L.bacterium[strain NK4A179]的LbaCas13a(偏好切割富含AC序列)和Prevotellasp.MA2016的PsmCas13b(偏好切割富含GA序列)，设计富含不同核苷酸且标记不同荧光基团的探针即可同时检测4种不同病原。SHERLOCKv2系统中还加入了CRISPR辅酶Csm6，使其检测灵敏度提高了3.5倍。

为进一步提高检测方法在生产现场的适用性，Myhrvold C等[22]将HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases)与SHERLOCK结合，直接对体液中的病毒进行检测。该平台通过直接加热失活核酸酶并裂解病毒即可进行后续反应。该平台可同时检测同一样品中ZIKV和DENV，灵敏性可达1 copy/μL[22]。Arizti-Sanz C等[34]对HUDSON进行了改进，可在10 min内快速灭活鼻咽拭子和唾液中的SARS-CoV-2，并将RPA扩增和Cas13检测在同一步骤完成，开发了SHINE(streamlined highlighting of infections to navigate epidemics)检测方法，大大提高了其在生产现场的检测能力。

同CRISPR-Cas12类似，研究人员也在尝试代替核酸扩增提高CRISPR-Cas13灵敏性的方法。Fozouni P等[35]报道了一种不需扩增即可用Cas13检测SARS-Cov-2的方法。通过联合使用针对靶标序列多个区域的crRNA激活Cas13酶活性，可使检测的灵敏性和特异性大大提高。2个～3个crRNA组合使用可使检测限达到30 copies/μL of SARS-CoV-2 RNA。另一种不需扩增的检测方法是将Cas13a酶切反应置于细胞大小的反应器中，提高局部反应混合物的浓度以增加灵敏度[36]。

3 展望

综上所述，CRISPR/Cas系统在病毒性传染病诊断领域发挥至关重要的作用。其中，CRISPR-Cas9是最早受到关注的基因编辑技术，而CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13则展示了其在病毒性疾病诊断中的优势和潜力。当然，从实验室开发到实际应用还有很多问题需要解决，比如CRISPR-Cas系统对错配率的耐受度可能导致脱靶效应或者假阳性结果。但不可否认，CRISPR-Cas系统是目前最有前景的诊断平台之一。而且，CRISPR-Cas系统种类多样，其发挥作用的关键蛋白组成、结构及作用机制也各不相同。深入分析CRISPR-Cas系统的新类型将有可能创建出更准确、简单、快速的诊断方法。