蛇麻草精油香薰法对氯苯丙氨酸诱导失眠大鼠的助眠作用研究*

田英姿，胡飞雪，王文博，庄文会，杜思鸿，刘思瑶，陈朋杰，赵培源

（1.河南中医药大学第一临床医学院，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学医学院，河南 郑州 450046）

失眠主要表现为入睡困难和/或睡眠维持障碍，对日间功能有显著影响，可导致情绪异常、注意力分散和认知功能障碍，影响人们的日常生活[1]，有失眠症状者占中国成年人群的57%左右[2]。目前治疗失眠的药物以镇静催眠类药物为主[3]，但长期服用会出现后遗效应和药物依赖甚至成瘾[4]。近年来研究发现，一些天然植物提取物具有镇静和催眠作用，如薰衣草精油中的芳樟醇能通过抑制大脑皮层中的谷氨酸（glutamic acid, Glu）受体介导的突触后兴奋而产生镇静和潜在的神经保护作用[5]，提示芳香植物挥发性化合物在改善睡眠方面具有潜在优势。蛇麻草是一种多年生草本植物，又称啤酒花。据《新疆中草药手册》记载，蛇麻草有镇静安神、清烦助眠的功效。蛇麻草精油中成分丰富，含有多种单萜和倍半萜烯化合物，如β-月桂烯、α-葎草烯、β-石竹烯等，具有镇静、助眠、抗炎、抗氧化等生物学活性[6]，但具体机制有待探索。本研究拟采用香薰法观察蛇麻草精油对失眠模型大鼠的助眠作用，并探讨其潜在的作用机制，为未来开发助眠的补充和辅助疗法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级 S D 大鼠共 7 2 只，6～8 周龄，体重 2 60～290 g，雌雄各半，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[生产许可证号：SCXK（鲁）20190003；使用许可证号：SYXK（豫）2021-0015]。实验大鼠饲养于河南中医药大学动物实验中心，12 h 昼夜交替，室温22～26℃，湿度40%～60%，大鼠自由摄食、饮水。所有动物实验经动物福利国际合作委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器

对氯苯丙氨酸（PCPA）[阿拉丁试剂（上海）有限公司，批号：A190846]，戊巴比妥钠[国药集团化学试剂（北京）有限公司，批号：TP20160910]，蛇麻草精油（广州慧怡生物科技有限公司），薰衣草精油[芙辉（天津）电子商务有限公司]，大鼠褪黑素（Melatonin, MT）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、大鼠γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）ELISA试剂盒、大鼠Glu ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公 司 ，货 号 ：MM-0657R1、MM-0441R1、MM-0601R1），磷酸二氢钠[阿拉丁试剂（上海）有限公司，批号：C2027088]，EDTA（北京索莱宝科技有限公司，批号：108J063），氯化钾（美国AMRESCO 公司，批号：1206B06），1-辛烷磺酸钠98%[阿拉丁试剂（上海）有限公司，批号：20190103024]，柠檬酸钠（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：16493-1996），磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20190107），甲醇（天津市四友精细化学药品有限公司，批号：632352-64487），pH 校准液（上海研衡仪器有限公司，批号：9027-2007），高氯酸（西陇化工股份有限公司）。低温离心机（大龙兴创实验仪器公司，型号：D1524R），旷场装置（江苏赛昂斯生物科技有限公司，型号：SA215.1），香薰灯（温州超派电子商务有限公司，货号：GX1168），自制香薰箱、多功能酶标仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司，型号：iMark]，高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：Vanquish Flex]。

1.3 实验方法

本实验流程如图1 所示。

图1 实验流程图

1.3.1 失眠模型的复制及分组 大鼠腹腔注射PCPA 悬浊液（300 mg/kg）复制失眠模型，连续4 d诱导失眠模型[7]。将PCPA 溶于含少量聚山梨酯的弱碱性溶液中，超声5 h，使PCPA 悬浊液更易注射。观察到大鼠失去正常昼夜节律，明显暴躁，毛色枯燥、黯淡无光泽，提示模型复制成功。共复制失眠模型大鼠63 只，死亡3 只，成功60 只，随机分为模型组、薰衣草精油组、蛇麻草精油低浓度组、蛇麻草精油中浓度组及蛇麻草精油高浓度组，每组12 只，雌雄各半，分别进行1～12 编号。另取12 只大鼠作为空白组，注射等量含少量聚山梨酯的弱碱性溶液。

1.3.2 治疗方法 各组大鼠在自制香薰箱中进行香薰。自制香薰箱为1个长60 cm×宽60 cm×高40 cm 的2层箱体，每层9 格，格与外界、格与格之间通风，如图2 所示。薰衣草精油组与蛇麻草精油组进行香薰处理，香薰时精油香薰灯置于中间格子里，每个大鼠放在1个格子中，薰衣草精油组以0.20%浓度香薰，蛇麻草精油组分别以0.05%、0.10%、0.20%浓度香薰；模型组和空白组熏蒸馏水。每天8 h，连续5 d。实验每天8:00～16:00 进行，周围安静，光线暗，温度（22±1）℃。观察动物模型复制和给药前后毛色光泽、睡眠与精神状态及饮食等变化并进行记录。

图2 自制香薰箱示意图

1.3.3 大鼠行为学评价 戊巴比妥钠协同睡眠实验的睡眠潜伏期和睡眠持续期：实验第9 天香薰结束后1 h，大鼠以40 mg/kg 给药浓度腹腔注射戊巴比妥钠溶液，根据翻正反射消失30 s 以上与否记录睡眠潜伏期和睡眠持续期的时间，以观察到的蛇麻草精油最佳有效浓度（高浓度0.20%）进行后续实验。旷场实验评价大鼠精神状态：实验第10 天，在长100 cm×宽100 cm×高40 cm 的旷场中进行实验，开始时将大鼠放至中间位置，使用ANY-maze软件自动追踪大鼠在旷场中的表现，记录其3 min内的行为，参数包括活动距离、穿格次数、理毛次数及站立次数，评价其精神状态。每只动物实验结束后用75%的酒精消毒。

1.3.4 标本采集 实验第10 天，大鼠称重后注射相应剂量的戊巴比妥钠麻醉。血清收集：腹主动脉取血，静置2 h 后于低温离心机中以3 000 r/min离心15 min，将血清分离出置于4°C 冰箱内保存。下丘脑采集：取脑，冰上分离大鼠下丘脑，以液氮迅速冷却后，-80℃保存。松果体采集：开胸暴露心脏将灌注针头插入心尖，剪开右心耳以开放静脉血，夹闭腹主动脉后先灌注约100 mL 生理盐水，在大鼠前肢及肺变白时停止灌注生理盐水开始灌注多聚甲醛，脑组织白而硬时即表示灌注成功。取出脑组织的松果体用4%多聚甲醛溶液固定。

1.3.5 ELISA 检测血清MT、GABA、Glu 含量 取大鼠血清，采用ELISA 法检测各组大鼠血清中MT、GABA、Glu 含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.6 高效液相色谱仪测定下丘脑中多巴胺（DA）、去加肾上腺（NE）、五羟色胺（5-HT）含量 取大鼠下丘脑，按照1 g∶10 mL 的比例向组织中加入预冷4℃的0.4 mol/L 高氯酸，匀浆后低温离心（14 000 r/min，15 min，4℃），取上清液，用0.22 μm 滤膜过滤样品后，高效液相色谱法检测DA、NE、5-HT 含量。色谱条件：色谱柱为C18（2.1 mm×100 mm，3 μm），流动相A 为磷酸二氢钠100 mmol/L，柠檬酸钠50 mmol/L，EDTA 50 μmol/L，辛烷磺酸钠1.7 mmol/L，氯化钾2 mmol/L，流动相B 为甲醇，A∶B=95∶5，设定流动相流速0.3 mL/min，柱温25℃，电化学检测器应用玻碳工作电极，工作电压520 mV，增益为100 nV，进样温度4℃，进样量20 μL。

1.3.7 松果体HE 染色 取大鼠松果体，常规脱水、包埋、切片、HE 染色，光学显微镜下观察各组大鼠松果体组织病理学变化。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态

PCPA 注射第2 天，与空白组比较，模型组大鼠表现出亢奋，活动增加，暴躁，饮食减少，饮水量明显增加。注射第4 天，大鼠失去正常昼夜节律，明显暴躁，毛色枯燥、黯淡无光泽，提示模型复制成功。连续5 d 每天8 h 香薰处理后，与模型组比较，薰衣草精油组和蛇麻草精油高浓度组大鼠精神状态平和，暴躁情况改善，饮食饮水趋于正常。

2.2 各组大鼠行为学比较

2.2.1 戊巴比妥钠协同睡眠效果 香薰后6 组大鼠睡眠潜伏期、睡眠持续期比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，模型组大鼠睡眠潜伏期较空白组延长（P＜0.05），睡眠持续期较空白组缩短（P＜0.05）；薰衣草精油组大鼠与蛇麻草精油高浓度组大鼠睡眠潜伏期较模型组缩短（P＜0.05），睡眠持续期较模型组延长（P＜0.05）；蛇麻草精油低浓度组睡眠潜伏期与睡眠持续期与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；蛇麻草精油中浓度组睡眠潜伏期与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05），而睡眠持续时间与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；蛇麻草精油高浓度组睡眠潜伏期与薰衣草精油组比较差异无统计学意义（P＞0.05），而睡眠持续期延长（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠睡眠潜伏时间和持续时间比较（n=8，）

表1 各组大鼠睡眠潜伏时间和持续时间比较（n=8，）

注 ：①与空白组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与薰衣草精油组比较，P ＜0.05。

睡眠持续时间/h 5.24±1.21 1.97±1.34①4.97±0.31②2.04±0.66 4.21±0.47②5.18±1.07②③41.935 0.000组别空白组模型组薰衣草精油组蛇麻草精油低浓度组蛇麻草精油中浓度组蛇麻草精油高浓度组F 值P 值睡眠潜伏时间/min 4.89±0.42 6.13±0.37①4.91±0.93②6.14±1.31 5.97±1.19 4.94±0.27②8.295 0.000

2.2.2 旷场实验结果 空白组、模型组、薰衣草精油组及蛇麻草高浓度组大鼠活动距离、穿格次数、理毛次数、站立次数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，模型组大鼠活动距离、穿格次数、理毛次数及站立次数较空白组缩短或减少（P＜0.05）；薰衣草精油组和蛇麻草精油高浓度组大鼠活动距离、穿格次数、理毛次数及站立次数较模型组增加（P＜0.05）；蛇麻草精油高浓度组与薰衣草精油组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠自发性活动行为和探索行为比较 （n=8，）

表2 各组大鼠自发性活动行为和探索行为比较 （n=8，）

注 ：①与空白组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别空白组模型组薰衣草精油组蛇麻草精油高浓度组F 值P 值站立次数28.53±9.16 7.68±7.44①21.46±10.05②17.98±5.36②14.244 0.000活动距离/cm 17.70±3.05 8.18±5.31①12.23±2.64②13.40± 2.44②11.967 0.000穿格次数131.00±18.36 66.17±36.46①97.33±16.62②103.50±21.89②11.347 0.000理毛次数26.50±7.26 8.00±6.60①17.56±5.88②14.62±2.83②9.936 0.000

2.3 各组大鼠血清MT、GABA、Glu 含量及Glu/GABA的比较

空白组、模型组、薰衣草精油组及蛇麻草精油高浓度组大鼠血清MT、GABA、Glu 含量及Glu/GABA 的比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，模型组大鼠血清MT、GABA 含量较空白组减少（P＜0.05），Glu 含量较空白组增多（P＜0.05），Glu/GABA 较空白组升高（P＜0.05）；薰衣草精油组和蛇麻草精油高浓度组大鼠血清 MT、GABA 含量较模型组均增多（P＜0.05），Glu 含量较模型组均减少（P＜0.05），Glu/GABA 较模型组降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清MT、GABA、Glu含量及Glu/GABA的比较 （n=8，）

表3 各组大鼠血清MT、GABA、Glu含量及Glu/GABA的比较 （n=8，）

注 ：①与空白组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别空白组模型组薰衣草精油组蛇麻草精油高浓度组F 值P 值Glu/GABA 6.94±0.90 14.59±2.69①9.13±1.08②8.62±2.41②11.689 0.001 MT/（μmol/L）56.72±5.06 44.07±3.33①67.29±5.62②67.88±4.16②35.254 0.000 GABA/（μmol/L）5.09±0.60 3.37±0.51①4.32±0.56②3.97±0.59②5.388 0.014 Glu/（μmol/L）35.30±6.28 48.18±6.28①39.07±3.46②42.42±6.82②7.236 0.005

2.4 各组大鼠下丘脑中DA、NE、5-HT含量比较

空白组、模型组、薰衣草精油组及蛇麻草精油高浓度组大鼠下丘脑中DA、NE、5-HT 含量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，模型组大鼠下丘脑中5-HT 含量较空白组减少（P＜0.05），NE 和 DA 含量较空白组增多（P＜0.05）；薰衣草精油组和蛇麻草精油高浓度组大鼠下丘脑中5-HT 含量较模型组均增多（P＜0.05），NE 和 DA 含量较模型组减少（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠下丘脑中DA、5-HT、NE含量的比较（n=8，μmol/L，）

表4 各组大鼠下丘脑中DA、5-HT、NE含量的比较（n=8，μmol/L，）

注 ：①与空白组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别空白组模型组薰衣草精油组蛇麻草精油高浓度组F 值P 值DA 2.46±0.27 3.91±0.23①2.53±0.14②2.50±0.12②5-HT 4.39±0.12 3.25±0.13①4.26±0.11②4.34±0.12②NE 55.51±5.67 61.23±5.14①57.24±8.43②55.95±6.79②6.001 0.010 64.426 0.000 108.862 0.000

2.5 各组大鼠松果体细胞和神经胶质细胞形态的比较

光学显微镜下，空白组松果体细胞和神经胶质细胞清晰均匀、排列规则紧密；模型组松果体细胞和神经胶质细胞排列分散杂乱、边界模糊，数目减少且有大量空泡样变性存在，细胞核缩小且位置异常；与模型组比较，薰衣草精油组与蛇麻草精油高浓度组细胞数目明显恢复，空泡样变性减少。见图3。

图3 各组大鼠松果体细胞和神经胶质细胞形态 （HE染色×400）

3 讨论

芳香植物精油通过香薰法进入鼻腔后，一方面可通过鼻黏膜进入嗅觉传导通路，形成神经冲动，沿嗅神经传导至相应的脑区产生活化作用，另一方面可进入肺部参与血液循环发挥作用[8-9]。传统医学认为芳香之品“能顺气，安神定志，合五脏”，调畅气机，入心经，可镇静安神、助眠除烦。本研究采用蛇麻草精油香薰法干预失眠大鼠，发现能改善其睡眠状态，提高自主活动能力，显示出蛇麻草精油潜在的治疗优势。

PCPA 是一种色氨酸羟化酶抑制剂，通过抑制5-HT 诱导失眠。腹腔注射PCPA 后，大鼠睡眠潜伏期延长，睡眠持续期缩短，睡眠、觉醒周期紊乱，与前期文献报道[10]一致，表明模型复制成功；0.2%蛇麻草精油香薰干预后，大鼠一般状态明显改善，毛色润泽，睡眠潜伏期缩短，睡眠持续期延长，表明蛇麻草精油香薰可改善失眠大鼠的睡眠状况。旷场实验常用于观察大鼠在新环境中的自主行为、活跃度和紧张度以评价大鼠焦虑抑郁心理以及精神状态，其中水平运动和垂直运动可以分别反映大鼠的探究能力及兴奋性、空间认知能力及警觉性[11]。本研究发现，模型组大鼠的运动距离、穿格次数、理毛次数和站立次数均降低，即水平运动与垂直运动均减少，由此可知，模型组大鼠情绪紧张，自主活动受限、警觉性较高，而经0.2%蛇麻草精油香薰后大鼠精神状态好转、自主行为活动恢复，水平运动与垂直运动增加，警觉性降低。

MT是松果体分泌的由交感神经支配的胺类激素。MT 分泌量常随昼夜节律波动，直接影响睡眠质量和节律，分泌水平下降可导致睡眠质量下降、节律紊乱、内分泌紊乱和神经功能障碍[12]。PCPA 能造成松果体细胞损伤[13]，影响MT的水平[14]，导致昼夜节律失调。本研究发现，模型组大鼠血清MT水平下调，松果体细胞排列紊乱、数目减少，而0.2%蛇麻草精油香薰后MT水平上调，松果体内细胞数目增多，细胞边界相对清晰，推测蛇麻草精油可以改善松果体结构损伤，调节MT的分泌，改善大鼠的睡眠。

研究表明，MT 调节睡眠的作用与Glu 和GABA水平密切相关[15]。Glu 和GABA 广泛参与睡眠机制调节，在兴奋、抑制调节过程中起重要作用。Glu 是大脑神经元突触体内的兴奋性递质，GABA 为抑制性递质；Glu 含量增加则神经元激活进而促使机体觉醒[16]；GABA 含量增加则抑制神经元兴奋从而促进睡眠[17]。MT 与其受体结合后能识别GABA 受体，通过增加氯离子内流激活GABA 受体，从而上调GABA 表达水平。Glu/GABA 比值常用来评价中枢神经系统功能兴奋和抑制状态[18]。ELISA 法检测血清GABA、Glu 的含量发现，模型组大鼠血清GABA 含量下降，Glu 含量和Glu/GABA 比值升高，经蛇麻草精油香薰后，以上指标的变化均有不同程度逆转。推测蛇麻草精油香薰法可能通过调节GABA、Glu 含量及两者比值来调节中枢神经兴奋性，改善睡眠。

5-HT 是具有抑制作用的单胺类神经递质[19]，MT 与位于视交叉上核细胞膜上的高亲和性G蛋白偶联受体特异性结合可促使机体内5-HT 含量增加[20]，导致觉醒时间缩短，影响睡眠、觉醒周期。NE 和DA 是具有兴奋作用的单胺类神经递质[21-22]。其中DA 能通过一系列催化反应生成NE[23]。高水平的NE 对中枢系统具有兴奋作用，使大脑处于异常兴奋状态，进而延长觉醒时间、缩短睡眠时间[24]。5-HT 和NE 维持了一种此消彼长的对立统一关系，共同调节机体的睡眠、觉醒周期。机体脑内5-HT浓度升高时，NE 浓度相对降低，机体进入睡眠状态，而NE 浓度升高时抑制5-HT 的释放，机体进入觉醒状态[25]。高效液相色谱仪测定各组大鼠下丘脑中NE、DA、5-HT 的含量发现，经蛇麻草精油香薰后，5-HT 含量增加，NE 和DA 含量减少，推测蛇麻草精油香薰法改善睡眠的作用可能与下调兴奋性神经递质、上调抑制性神经递质有关。

综上所述，蛇麻草精油香薰法能改善失眠大鼠的入睡潜伏期和睡眠持续时间，其机制可能可能与改善松果体结构，促进MT、抑制性递质GABA 及5-HT 的分泌，以及抑制兴奋性递质Glu、NE、DA 的分泌有关。本实验结果为蛇麻草精油香薰作为镇静助眠的辅助治疗提供了理论依据。