内皮素-1在低氧性肺动脉高压发生发展中的作用

袁好鑫 刘幸幸

肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)按照其发病机制的不同分为五大类[1]，低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是PH中的第三大类。HPH是由慢性阻塞性肺疾病、限制性肺疾病、其他限制性/阻塞性混合肺疾病、或低氧环境的长期存在导致的肺动脉压力升高，肺血管发生不可逆性的转变，其中肺动脉重塑，是导致HPH严重恶化和难以逆转的主要原因。缺氧是导致肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)异常增生，肺动脉外膜成纤维细胞激活的主要原因[2]。低氧的持续存在使肺动脉血管内皮发生改变，内皮细胞分泌失衡，内皮素-1(endothelin-1, ET-1)在低氧的刺激下分泌增多[3]。ET-1是迄今为止所知道的最强的内源性缩血管物质。ET-1不仅具有缩血管的作用，还具有促进有丝分裂、平滑肌细胞增殖、促进炎症反应等作用[4]。

ET及其受体的发现及分型

Hickey等人于1985年首次发现内皮细胞分泌的血管收缩肽。Yanagisawa等人在1988年分离并克隆了由21个氨基酸构成的内皮素(endothelin, ET)[5]。ET由多种器官产生。其中ET-1主要是由血管内皮细胞产生的，也是最丰富、最重要的ET。ET-1由内皮细胞向底层平滑肌的表面分泌，并以旁分泌或自分泌的方式起作用[6]。几乎由所有细胞都能够合成成熟的ET-1，在血管内皮细胞和平滑肌细胞、气道上皮细胞和平滑肌细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、心肌细胞、系膜细胞、足细胞和脑神经元中高表达。发现ET-1后不久，又发现了两种结构相关的肽，分别被称为ET-2和ET-3，分别由2和6个氨基酸构成。ET-2缺失会导致体温过低、肺气肿、生长迟缓和代谢异常，包括低血糖和酮症酸血症。缺乏ET-2的动物很早就会死亡，这表明ET-2在生理学和疾病中的重要作用仍然没有得到充分认识。ET-3在胎盘、脑神经元、黑素细胞、肾小管上皮细胞、肠上皮细胞等细胞中表达，主要介导血管扩张剂和抗炎分子，如一氧化氮(Nitric Oxide, NO)和前列环素(prostaglandin, PG)的释放，并可能促进某些类型细胞的生长，如黑色素细胞[7]。

内皮素的生物合成是通过血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VEC)中的内皮素基因转录开始的，然后将其翻译成内皮素原(合成前体)和大内皮素(一种无生物学活性的中间体)，内皮素原和大内皮素再被特定的内皮素转换酶(endothelin-converting enzymes, ECE)进一步裂解为ET-1,ET-2和ET-3亚型[8]。ET-1通过作用于内皮素受体(endothelin receptor, ETR)来发挥作用，有两种不同的ETR, 分别为ETAR和ETBR，它们是G蛋白偶联受体家族的一部分，具有七个跨膜结构域[9]。ETAR和ETBR在所有研究的细胞类型中同时表达。这两种内皮素受体的激活对血管张力的影响差异的主要原因在于它们的在不同组织中表达优势不同[10]。这两种受体都存在于动脉血管平滑肌上，其中ETAR占主导地位。位于血管平滑肌细胞上的ETAR可介导血管收缩和血管平滑肌细胞增殖，ET-1与ETAR结合后激活Gq11蛋白和G12/13蛋白，激活的Gq11蛋白和Gq12/13蛋白激活磷脂酶C(phospholipase C , PLC)，PLC将磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate,PIP2)水解成二酰基甘油(diacylglycerol, DAG)和肌醇三磷酸(inositol trisphosphate, IP3)。IP3直接激活内质网上的钙泵，动员钙离子(calcium, Ca2+)进入细胞内，导致血管平滑肌细胞收缩和增殖动脉血管收缩。ET-1通过与ETB结合，可以产生舒张动脉或收缩动脉的不同效应。ET-1以自分泌的途径与内皮细胞上的ETBR结合后，可引起血管扩张剂的释放，主要包括NO和PGI2，从而介导血管扩张和抑制血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖，这种反馈机制可以减弱ETAR的收缩动脉的作用。位于VSMC上的ETBR与ET-1结合后也可以激活G12/G13蛋白从而收缩动脉。内皮细胞和VSMC上ETBR表现出不同的作用，导致一些研究者假设它们是两种不同的受体：ETBR1和ETBR2。然而，除了组织定位外，没有证据表明内皮和VSMC上的ETBR有其他不同。三种内皮素对以上两类受体亚型的相对结合亲和力分类如下：对第一种受体亚型ETAR的亲和力顺序为：ET-1>ET-2>ET-3；而对第二受体亚型ETBR三种ET表现出等电位亲和力。ET-1与ETA受体紧密结合，产生强烈、持久的收缩作用，且受体转换率低。这种延长缩血管效应可能是由于受体定位在小窝中，内化率低。另一方面，ETBR在激活后通过磷酸化迅速内化和失活，因此引起更短暂的反应[8]。

ET-1在HPH中起到的作用

缺氧是ET-1强大的诱导剂，当机体由于各种肺部疾病或处于长期低氧的环境时，肺动脉内皮细胞受损，分泌功能失衡，造成舒张血管的物质分泌减少，收缩血管的物质分泌增多，如ET-1分泌合成增加。缺氧条件下，肺血管内皮细胞上的ETAR上调，导致肺血管对ET-1反应性增加，ET-1的作用增强[3]。ET-1在HPH发生发展中起重要作用，与ETAR结合后，诱导肺血管收缩，刺激PASMCs增殖和血管重塑。

一、ET-1促进肺血管收缩重塑

肺动脉在低氧的条件下，会持续收缩，长期的低氧导致PASMCs增殖，以小、中型肺动脉管壁向心性增厚和管腔闭塞为特征的血管收缩和血管重塑是导致肺动脉压力升高的主要原因，肺血管重塑是HPH发展的基本特征[11]。在肺血管重塑的过程中，肺血管收缩起到了主要作用，血管平滑肌收缩、细胞骨架功能选择性改变作用于肺血管顺应性的信号通路，这些通路主要参与介导慢性缺氧性血管收缩，并且会加速右心室超负荷的发展，加速推动了PAH的进展[12]。ET-1对血管平滑肌的主要作用是促进血管收缩、平滑肌细胞增殖、动脉粥样硬化[13]。ET-1主要通过刺激血管平滑肌中的ETAR来发挥收缩血管的作用，ET-1通过介导Ca2+进入细胞质促进动脉收缩。胞浆中Ca2+的增加是双相的，首先从细胞内释放，然后从细胞外液进入[10]。一方面ET-1与ETAR结合后通过Gq11/12/13蛋白激活PLC，然后产生IP3和DAG，导致细胞肌质网上的钙泵激活，Ca2+释放进入胞质中；另一方面Ca2+也可能来自细胞外，这是因为肌质网内Ca2+的减少激活了钙池操纵的阳离子通道(store-operated cation channels)，而DAG可以激活受体操作的阳离子通道(receptor-operated cation channels)，这两种类型的通道都允许细胞外Ca2+内流。细胞质中Ca2+增加，可与钙调蛋白结合，由此产生的Ca2+/钙调蛋白复合物与肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase, MLCK)结合，磷酸化肌球蛋白轻链(Myosin light chain, MLC)并促进肌球蛋白与肌动蛋白结合，从而导致血管收缩[14]。ET-1在大多数哺乳动物物种(包括人类)体内和体外都能引起极强和持久的血管收缩。静脉注射ET-1时体内血流动力学反应非常复杂，取决于血管床。ET-1引起血流动力学改变的方式包括直接血管收缩效应和间接效应，间接效应是指由于强效的血管收缩导致内皮源性舒张因子释放并介导产生血管扩张、抑制血管收缩反应等。除了急性血管收缩作用外，ET-1还对血管组织产生慢性作用。慢性作用似乎与血管疾病相关的增殖反应有密切关联，通过刺激ETAR，可诱导人与猪的巨噬细胞和内皮细胞培养物中的ETmRNA表达和ET-1的释放、VSMC的增殖。ET-1能刺激c-fos、c-jun、c-myc135的表达，增加胸腺嘧啶核苷酸进入DNA，并导致VSMC和成纤维细胞增殖[4]。ET-1在HPH的血管重塑进程中，通过刺激血管收缩、增加血管平滑肌增殖起到了重要的作用。ET-1加速了肺血管重塑的过程，使HPH的病情恶化速度更快。

二、ET-1抑制细胞凋亡促进细胞增殖及有丝分裂

ET-1不仅是一种强效的血管收缩剂，还是一种强大的促有丝分裂剂。HPH的发生发展过程中，细胞凋亡的失衡起到了重要作用。过度增殖和抗凋亡的PASMCs是血管重塑的关键组成部分[15]。ETAR和ETBR都能调节体外培养的人PASMCs的增殖。ET-1在体内作用的潜在靶点主要位于肺血管内膜损伤处的细胞，主要包括平滑肌细胞和肌成纤维细胞[16]，ET-1还能刺激肌成纤维细胞收缩，并分泌胶原凝胶[17]。肌成纤维细胞是一种收缩性间充质细胞，其表型介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间，它们合成、分泌、组织和重塑细胞外基质，肌成纤维细胞凋亡不足与进行性细胞外基质沉积和收缩相关，并可导致肺组织纤维化，肌成纤维细胞凋亡是创伤修复的关键。ET-1具有促肺成纤维细胞增殖作用，ET-1通过激活PI3K/AKT信号通路抑制肌成纤维细胞凋亡，从而加剧肺动脉重塑[18]。ET-1还可以通过发挥抗凋亡作用来调节血管生长，NO可以激活caspase-3通路诱导细胞凋亡，ET-1可以激活MAPKK/MAP激酶通路，对抗NO的促凋亡机制，发挥其抗凋亡的作用。MAP激酶通路在细胞增殖和分化中起着重要作用，ET-1以剂量依赖的方式激活静止的肺血管VSMC中的MAP激酶活，来发挥抗凋亡作用[19]。在HPH的发展中细胞凋亡的失衡也是重要的环节之一，ET-1在低氧条件下产生增多，又加剧了细胞凋亡的失衡，从而加剧了HPH的形成。

三、ET-1的促炎作用

低氧本身可以诱发炎症反应，称为低氧性炎症[20]。炎症反应造成肺血管内皮损伤，导致内皮细胞功能障碍，不仅损害了正常肺血管内皮细胞介导的静止性平滑肌细胞抑制，还会造成抗凋亡内皮细胞克隆性扩张，促进了增殖性血管病变，同时还涉及到与外膜成纤维细胞、血管周围炎性细胞和细胞外基质复杂的相互作用[21]。炎症和炎症介导的内皮功能障碍是HPH形成的重要原因之一。T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和其他炎症细胞浸润在HPH患者周围动脉丛状病变中。在HPH肺血管重塑过程中，炎症细胞不但涌入血管壁中，而且在肺组织和肺循环中也可发现各种炎症标志物的高表达[22]。HPH患者的炎症因子水平显著升高。炎症因子受核转录因子NF-κB调节，NF-κB广泛存在于真核细胞中，是一种属于“Rel”家族的核转录因子。NF-κB主要与细胞内的信息传递有关，调节大量基因的表达，对细胞凋亡、病毒复制、肿瘤发生、炎症和各种自身免疫性疾病的调控至关重要。它包含一个RHD域(Rel homology domain, RHD)，通常由RELA(P65)和P50组成。这种异二聚体及其抑制分子IκB(NF-κB抑制剂)在失活状态下，在细胞质中形成三聚体。激活NF-kB被认为是应激反应的一部分。当上游信号在多种因素包括细胞因子，炎症介质，病原体，氧化应激等的作用下激活IκB时，NF-κB被激活进入核内激活免疫反应和细胞分化等过程。NF-κB激活的基因主要含有细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6、粘附分子，病毒蛋白生长因子，酶等)。在应激反应、炎症和凋亡的过程中NF-κB发挥着独特的作用[23]。TOLL样受体(Toll-like receptors, TLR)家族参与先天性免疫和获得性免疫，并激活一些信号通路，其中TLR4/NF-κB信号转导通路参与HPH的发病机制，TLR4/NF-κB可能反映COPD患者肺动脉高压的严重程度。TLR4/NF-κB信号通路与抗炎和免疫机制密切相关，它在炎症的发生和发展中起着重要的作用[23]。ET-1通过增加血管壁的氧化应激引起炎症反应，从而诱导血管重塑和内皮功能障碍。ET-1显著增加IκB的磷酸化，降低其对NF-κB的抑制作用；另一方面，它能刺激VSMC产生细胞粘附蛋白1和环氧合酶2从而刺激血管炎症反应的发生[24]。低氧可以诱导炎症发生，炎症又加剧了内皮细胞的损伤，使得肺动脉重塑的进程加速，二者形成恶性循环，ET-1促进了炎症的发生，加剧了炎症的程度，从而促进HPH的进展。

四、ET-1促进心室肥厚及重构

HPH的患者最终死于终末期的右心衰竭。由于肺动脉压力长期升高，加重右心室后负荷，导致右心室肥厚，右心重构，短期内右心尚可代偿，长此以往，右心室后负荷进行性升高，导致右心衰竭[25]。右心室压力超负荷导致早期双心室纤维化、凋亡、重构和功能障碍，并随着持续的右心室压力升高而恶化[26]。Rho激酶(rho-kinases, ROCKs)参与调节多种细胞的多种生物学功能。Rho家族的成员，包括RhoA、Rac1和Cdc42，对细胞迁移至关重要，它们的活动需要紧密协调才能允许细胞移动。RhoA是各种细胞外信号的分子开关，参与调节前沿膜的突起、移动细胞体和增强尾部的收缩力[27]。ROCK的异常激活可能导致心血管疾病的发生，包括高血压和心室肥厚，ROCK激活可能在氧化应激和冠状动脉功能障碍机制中起核心作用，其机制是增强ET-1对内皮细胞的收缩作用和削弱NO介导的血管内皮细胞舒张作用。ET-1通过激活PLC途径和MLCK，增加细胞内Ca2+浓度，从而诱导血管收缩，通过激活ROCK延长MLC磷酸化时间。ROCK可以调节收缩肌丝的钙敏感性和磷酸化，从而调节平滑肌收缩力。鉴于增加的机械应力(如高血压)可激活血管壁的ROCK信号，血管平滑肌中ROCK对肌丝收缩动力学的增强可能有助于增强ET-1对血管的收缩[28]。ET-1对心血管的不良影响已被很好地描述，包括肺血管收缩、心室舒张功能受损、并且ET-1可促进心室肥厚和纤维化，因此可作为预防或治疗导致右心室功能障碍的心肌重塑和纤维化的药物靶点[26]。有研究表明，ET阻滞剂(endothelin receptor blockers, ERB)可以减轻右心室重构，这一作用是通过抑制TGF-1信号来改善心肌纤维化和凋亡，与减轻肺血管阻力和右心室后负荷无关。右心系统作为肺动脉高压直接作用的靶器官，ET-1可以直接作用于右心系统，使右心室发生纤维化，心肌肥厚，并且损伤左心系统，加剧了HPH的发展。

ET-1拮抗剂与HPH的治疗

HPH目前为止仍旧缺乏有效的治疗措施，对于长期居住于高海拔地区所引起的高海拔地区肺动脉高压(high-altitude pulmonary hypertension, HAPH)患者，移居到低海拔地区，是最为行之有效的方法，无法移居的患者，可以采用氧疗的方法，也能使病情得到控制[29]。

但对于治疗HPH的药物研究没有特别重大的进展。ET-1在HPH的发生发展过程中起到了重要的作用，非特异性ETR阻断剂代表药物波生坦也被应用于HPH的治疗过程中。研究表明，波生坦可有效减轻健康受试者缺氧性肺血管收缩(Hypoxic pulmonary vasoconstriction, HPV)，在低氧环境下，波生坦可以提高高强度运动有氧运动的能力，有效降低HAPH患者的收缩期肺动脉压力，与吸氧时的肺动脉压力相当[30]。低氧期间肺外膜成纤维细胞(pulmonary adventitial fibroblasts, PAFs)表型的变化是低氧性肺血管重塑的基础，PAFs释放PASMC有丝分裂原，促进PASMC增殖，而PASMC在低氧刺激中是相对被动的参与者，波生坦与PAFs相互作用中减弱了PASMC的增殖[31]

选择性ETA阻滞剂和非选择行ETR受体拮抗剂均可用于降低急性缺氧时的右心室后负荷,甚至可以部分或在某些情况下完全阻止慢性缺氧大鼠肺动脉重构和/或PH的发展[32]。针对ETAR的免疫治疗中，ETRQb-002疫苗和单克隆抗体都显著降低了缺氧暴露小鼠的右心室收缩压，通过抑制ET-1引发的信号转导，有效地减轻了缺氧诱导的肺动脉高压动物的肺小动脉和右心室重构，降低了右心室收缩压[33]。ET-1诱导的HPV作用增强，是缺氧时人体最大运动能力的限制因素，因为这会增加右心室后负荷，从而降低最大心输出量[32]。选择性内皮素A受体拮抗剂西他生坦，对HPV的抑制能够持续改善高海拔地区正常受试者有氧运动能力，西他生坦的肺血管舒张作用在慢性低压低氧暴露期间持续存在，部分逆转了低氧诱导的收缩期肺动脉压力升高，增加氧气摄取能力[34]。有研究表明ET-1的有效生理拮抗剂胃饥饿素，减弱了低氧诱导的ET-1 mRNA的过度表达，显著减轻肺动脉高压、肺血管重塑和右心室肥大的发展[35]。

近年来，有很多有关于中医药治疗HPH的相关研究，与西药的昂贵的价格相比，中医药的价格更加低廉，且中医治疗肺动脉高压历史悠久。但是由于成分的不确定性，以及机制原理缺乏说服力效果并不是很乐观。黄芪甲苷是从黄芪中提取的高纯度药物，在中国是一种被广泛使用的草药，研究表明黄芪甲苷抑制了缺氧诱导的ET-1和血管紧张素Ⅱ的升高，在HPH大鼠中放松肺动脉环，并且在缺氧暴露后24小时后显著抑制PASMC增殖，并以剂量依赖性方式降低了血清TNF-α和IL-6水平，降低肺动脉压力，有治疗HPH的潜力[36]。灯盏花 , 又名灯盏细辛 , 系菊科飞蓬属植物短葶飞蓬，主要成分为灯盏花乙素 , 其中具有黄酮类成分 , 可以扩张微动脉、改善微循环、降低血液粘滞度 , 在临床上主要治疗心脑血管缺血性疾病，研究证明灯盏花素可明显降低低氧大鼠mPAP, 降低血清 ET-1含量水平 ,在治疗低氧性肺动脉高压中取得了较好疗效[37]。还有很多相关的中药治疗HPH的研究，其中大部分有治疗作用的中药都可以使ET-1下降。

HPH的发生发展是一个非常复杂的过程，并不是单纯的几个因素作用导致的，所以其治疗仍然缺乏特效药物及方法。ET-1虽然在HPH的形成过程中起到了很重要作用，但是单纯的针对拮抗ET-1的治疗虽然有效果，但其效果不足以根治HPH。因此，在未来的研究中需进一步探索治疗HPH的药物及方式。

结 语

综上所述，ET-1以其强大的血管收缩作用、促增殖及有丝分裂作用和促炎症作用在HPH的发生及进展中起到了重要的推动作用，并且可以直接促进右心室重构，使心肌纤维化、肥厚，造成HPH的进展更加迅速。目前为止HPH仍旧缺乏行之有效的治疗方法及特效药物，ERB在HPH的治疗过程中会起到一定的作用，但是仍然不能完全逆转HPH。但针对ET-I及HPH的研究从未停止，希望未来有更有效的治疗方法或者药物。