抗p21Ras蛋白抗体研发及在肿瘤病理和肿瘤治疗中的研究进展

石英贤，潘鑫艳，冯 强，郑慧元，杨举伦

ras基因是1982年麻省理工学院Parada等[1]从人膀胱癌细胞中分离获得的第一个人类癌基因。约30%的肿瘤中存在ras基因突变[2]。p21Ras蛋白是ras基因表达产物。ras基因突变产生的突变型p21Ras蛋白不易被GTP水解，使ras信号通路持续激活，导致细胞增殖和恶变[3]。野生型p21Ras蛋白的过表达也可持续激活ras信号通路导致肿瘤发生[4]。因此，研发抗p21Ras蛋白抗体对于ras基因驱动肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。该文结合文献对抗p21Ras蛋白单克隆抗体、单链抗体、细胞内抗体、重组抗体的研发和应用进行简要综述。

1 抗p21Ras抗体的研发

1.1 抗p21Ras单克隆抗体单克隆抗体是针对抗原分子上某一特定抗原决定簇的抗体，采用杂交瘤技术制备[5]。20世纪80年代是抗p21Ras单克隆抗体研究的高峰时期。Furth等[6]以H-p21Ras为免疫原制备获得了8株抗p21Ras单克隆抗体，这些抗体均能与磷酸化和非磷酸化的H-p21Ras蛋白发生免疫反应，其中Y13-259、Y13-128、Y13-4还能与K-p21Ras蛋白结合。Hand等[7]以H-ras基因产物中10-17位氨基酸组成的肽段为免疫原，制备了5株抗p21Ras蛋白单克隆抗体，依次命名为RAP-1～5。1988年Yoshida等[8]将大肠杆菌表达的K-p21Ras蛋白作为免疫原制备了16株小鼠单克隆抗体，依次命名为RASK-1～16。1986年Kuzumaki等[9]使用大肠杆菌表达的H-p21Ras蛋白作为免疫原制备了4株抗p21Ras单克隆抗体，分别命名为rp-12、rp-28、rp-35、rp-38。本实验室于2009年成功制备了可与H-p21Ras、K-p21Ras，N-p21Ras结合的广谱单克隆抗体KGH-R1[10]。

1.2 抗p21Ras单链抗体单链抗体由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽连接而成[11]。单链抗体较好地保留单克隆抗体与抗原结合的活性，分子量只有单克隆抗体的1/6，且由于没有单克隆抗体的Fc片段不会导致免疫排斥反应，具有作为治疗性抗体的优势。

抗p21Ras单链抗体Y238-scFv和Y259-scFv均由相应单克隆体衍生而来，两者与p21Ras蛋白都有较好的免疫反应性，能结合肿瘤细胞中的p21Ras蛋白[12]。Lener等[13]利用噬菌体展示技术从两个不同抗体片段文库中筛选出5个不同序列的p21Ras单链抗体，这些单链抗体经亲和层析纯化后与p21Ras蛋白有较好的亲和力，能有效地抑制野生型或突变型ras的功能。本实验室应用噬菌体展示技术获得了抗p21Ras蛋白的单链抗体，命名为KGH-R1 scFv[14]。酶联免疫吸附法、免疫组化、印迹杂交、免疫荧光、同源模建和分子对接研究显示，KGH-R1 scFv与野生型和突变型的H-p21Ras、K-p21Ras、N-p21Ras产生较好的免疫结合[15]。

1.3 抗p21Ras细胞内抗体细胞内抗体是一种携带抗体基因的表达载体，进入细胞后在细胞中将所携带的抗体基因表达为抗体。常用的基因表达载体有表达质粒和腺病毒。Cochet等[12]将Y259-scFv基因插入Ad5型腺病毒载体中，获得了细胞内抗体Ad-Y259-scFv。2016年本实验室将KGH-R1 scFv的基因克隆到复制缺陷型Ad5型腺病毒载体中，获得细胞内抗体KGHV100(或重组腺病毒KGHV100)，可以感染具有柯萨奇受体的细胞并在胞质内表达KGH-R1 scFv[16]。

1.4 抗p21Ras重组抗体重组抗体也称为基因工程抗体，是通过DNA重组技术将抗体基因序列进行改造和重组，构建于表达质粒上，再通过蛋白外源表达技术将构建好的质粒转染到适合的宿主细胞中表达而获得。本实验室将上述KGH-R1 scFv基因与肿瘤穿膜肽基因连接，克隆到表达质粒上，在大肠杆菌表达系统中表达，获得三种抗p21Ras重组抗体，分别名为RGD-KGH-R1 scFv、ACPP-KGH-R1 scFv、BR2-KGH-R1 scFv。其中RGD-KGH-R1 scFv可穿入表面有整合素的肿瘤细胞[17]，ACPP-KGH-R1 scFv可穿入表面有基质金属蛋白酶2的肿瘤细胞[18]，BR2-KGH-R1 scFv可穿入表面有神经节苷脂的肿瘤细胞[19]。2017年Shin等采[20]用同样方法将RGD10细胞穿膜肽与抗p21Ras单克隆抗体基因RT11-i连接，在大肠杆菌中获得重组抗体，该抗体可通过结合整合素avb3或avb5进入肿瘤细胞，在细胞内仍具有与p21Ras-GTP结合的特异性。

2 抗p21Ras抗体的应用

2.1 在肿瘤病理中的应用抗p21Ras抗体主要用于研究ras基因在肿瘤发生发展中的作用。Hand等[7]使用RAP-1～5单克隆抗体作为一抗，应用免疫组化在人类结肠癌和乳腺癌组织中检测到p21Ras蛋白，而在纤维腺瘤和纤维囊性疾病、正常乳腺和结肠上皮组织中未检测到p21Ras蛋白。Yoshida等[8]应用RASK-3单克隆抗体、通过免疫组化检测101例胃癌、53例非癌胃组织中p21Ras的表达，发现其表达于高分化胃癌、肠化生和不典型增生胃组织中。Kuzumaki等[9]利用rp-12单克隆抗体、通过免疫荧光实验证实：p21Ras蛋白在人黑色素瘤中高表达，在普通痣中无表达。本实验室应用KGH-R1单克隆抗体分析p21Ras在结直肠良恶性病变[21]、乳腺良恶性病变[22]、胃黏膜良恶性病变[23]、甲状腺良恶性病变[24]、肺良恶性病变[25]及肝脏良恶性病变中的表达[26]，结果显示p21Ras在癌组织中高表达，而在正常组织中不表达或低表达，提示ras基因在这些肿瘤的发生中起重要作用。上述抗体不仅可用于评价良、恶性病变组织中p21Ras表达的差异，还为研究ras基因在细胞生长调控和肿瘤转化中的作用提供重要的工具。目前商品化的抗p21Ras抗体有K-p21Ras多克隆抗体RAB(迈新公司)、单克隆抗体c-4(Santa Cruz公司)、重组抗体EP1125Y(Abcam公司)等。

2.2 在肿瘤治疗中的应用目前，治疗性抗p21Ras抗体仍处于研发阶段，尚无靶向p21Ras的抗体药物上市。细胞内抗体KGHV100是基于复制缺陷型腺病毒构建，能够携带抗体进入肿瘤细胞，但不能持续表达。为此，本实验室构建了携带KGH-R1 scFv基因的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV300[27]和KGHV500[28-29]。KGHV300可在肿瘤细胞中复制增殖，而在正常细胞中不复制，延长了基因表达时限，提高了治疗效果。KGHV500可在肿瘤细胞中复制并持续表达KGH-R1 scFv基因，研究显示它能在体内、外抑制结直肠癌[30]、胃癌[31]、非小细胞肺癌[32]、脑胶质瘤[33]、肝癌[34]的增殖和生长。用CIK细胞作为二级载体，可以通过血液途径将KGHV500运送到肿瘤部位，为体内脏器肿瘤和转移性肿瘤的治疗提供了可能性。连接细胞穿膜肽抗p21Ras的重组抗体RGD-KGH-R1 scFv、ACPP-KGH-R1 scFv、BR2-KGH-R1 scFv，在肺癌、结直肠癌、脑胶质瘤等肿瘤的研究中显示了较好的抗肿瘤活性[17-19]。

3 结语

ras基因与肿瘤的发生发展密切相关[35]。目前，针对p21Ras蛋白的小分子化合物抑制剂AMG 510已经上市，MRTX 849已经进入临床试验，抗体药物仍处于研发阶段[36-38]。抗p21Ras单克隆抗体能够用于检测正常组织和肿瘤组织中p21Ras的表达以辅助病理诊断。腺病毒携带抗p21Ras抗体基因进入细胞后，能够在肿瘤细胞内表达抗p21Ras抗体。然而，腺病毒的制备及保存较为困难，且不利于规模化生产。与细胞穿膜肽融合表达的重组抗体有望成为治疗ras基因驱动肿瘤的抗体药物，其开发和规模化生产将给ras相关肿瘤患者带来福音。