双酶复合两步水解法制备玉米降血糖活性肽及其生物活性

赵婉宏， 郑喜群,2,， 刘晓兰， 王俊彤,2， 姜彩霞， 李冠龙

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319) (粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心2，大庆 163319) (国家杂粮工程技术研究中心3，大庆 163319) (齐齐哈尔大学食品与生物工程学院4，齐齐哈尔 161006)

糖尿病是一种代谢性疾病，目前主要通过人工合成的药物来治疗糖尿病，长时间服用会出现肝肾功能的损伤、水肿等症状，对人体健康有一定的副作用[1，2]。通过遏制餐后高血糖可以预防糖尿病转化，人体内的α-葡萄糖苷酶可以将淀粉和低聚糖水解成葡萄糖[3]，小肠黏膜上吸收速度加快，引起餐后高血糖。故抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以减少单位时间内葡萄糖产生进而起到降低血糖的作用[4，5]。食物来源的蛋白酶解物及肽类具有易吸收、安全性好等特点，在功能性食品开发上具有潜在价值。Wang等[6]发现燕麦球蛋白肽对α-葡萄糖苷酶具有调节作用，可作用于调节血糖的多个靶点，达到调节血糖的作用；魏睿婷[7]以油用牡丹籽粕为原料，通过体外α-葡萄糖苷酶抑制实验制备得到的降血糖肽证实其具有较强的降血糖活性；吴彤[8]通过对核桃活性肽的制备、纯化、结构鉴定并利用α-葡萄糖苷酶抑制率实验验证核桃活性肽活性，确定其具有明显降血糖功效。

玉米黄粉是玉米湿法淀粉加工中产量最大、蛋白质最高的副产物，玉米黄粉中含有60%的蛋白质，其中富含大量活性氨基酸，但由于其含有的醇溶蛋白和谷蛋白溶解性差，限制了玉米蛋白在食品工业中的应用。玉米肽是玉米黄粉经蛋白酶水解或微生物发酵后获得的低分子质量产物。与玉米黄粉相比，玉米肽的水溶性显著增加并具有促进乙醇代谢[9]、抗氧化、降血压、抗炎等功能活性[10-12]。目前酶法水解蛋白条件温和、副产物少，并能保留水解物的营养价值，从蛋白质水解效果和水解物活性角度考虑，双酶协同水解法比单酶水解法效果要好。

本研究以玉米黄粉为原料分别利用4 种蛋白酶进行单酶水解后，筛选出风味蛋白酶和碱性蛋白酶对玉米黄粉进行分步水解，利用单因素确定最佳酶解时间、温度、pH、加酶量继而进行正交实验得到最优酶解条件，以水解度及α-葡萄糖苷酶为指标考虑两种加酶顺序选取最优组合，并对其水解物通过超滤分级得到不同组分的酶解液，并进行体外抗氧化活性测定及相关性分析，本研究为玉米蛋白水解物在降血糖功能食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米黄粉(蛋白质质量分数56%)、碱性蛋白酶(酶活力200 U/mg)、风味蛋白酶(酶活力30U/mg)；木瓜蛋白酶(酶活力80 U/mg)、中性蛋白酶(酶活力50 U/mg)、α-淀粉酶(酶活力50 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(酶活力50 U/mg)、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷；无水乙醇、铁氰化钾、硫酸亚铁、氯化亚铁、氯化铁、三氯乙酸、水杨酸、过氧化氢，所有无机试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

ZNCL-GS190×90磁力搅拌锅，RNF-0460卷式膜多功能小试设备，ZSHW型电热恒温水浴锅，CHRISTALPha型冷冻干燥机，LGR10台式高速离心机，DL-5型大容量低速离心机，HD-9707电脑紫外检测仪。

1.3 方法

1.3.1 玉米黄粉的预处理

采用挤压膨化和去淀粉处理得到预处理玉米黄粉(蛋白质质量分数为80%)[13]。

1.3.2 玉米蛋白的酶法水解

将预处理玉米黄粉按料液比1∶10分散，在碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶最适酶解温度、添加量和pH下于磁力搅拌锅内水解5 h。水解结束后100 ℃加热灭酶20 min，离心取上清液测定水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率，并以此筛选出2个效果较好蛋白酶进行工艺优化。

表1 不同蛋白酶最适酶解条件

1.3.3 双酶复合两步水解法条件优化

根据所选蛋白酶进行优化，固定底物含量100 g/L不变，改变反应时间、温度、pH值和加酶量进行单因素正交实验，测定不同条件下的α-葡萄糖苷酶抑制率、水解度和蛋白质回收率，来确定两种酶的最佳反应条件。而后对酶添加顺序进行优化，测定不同添加顺序下酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制率、水解度和蛋白质回收率，以确定玉米降血糖活性肽酶解最佳条件。

1.3.4 不同分子质量水解产物的制备

选用截留分子质量为10、5、1 ku的超滤膜对已制备的酶解液进行超滤处理。截留>10、10～5、5～1、<1 ku 4个组分，超滤压力为0.1 MPa，温度为室温。

1.3.5 不同分子质量水解产物活性测定

1.3.5.1 不同分子质量水解产物α-葡萄糖苷酶体外降血糖活性的测定

体外α-葡萄糖苷酶活性测定采用了吴晖等[14-17]方法并进行适当修改，取3.0 mL磷酸钾缓冲液(67 mmol/L，pH 6.8)，100 μL的玉米蛋白酶解液(50 mg/mL，抑制剂)，0.5 mL 的PNPG底物溶液(0.01 mol/L),37 ℃保温5 min后，加入0.5 mL 37 ℃预保温的α-葡萄糖苷酶溶液(0.4 mg/mL)，于37 ℃水浴下恒温反应60 min，再以5 mL 质量分数为4%的Na2CO3溶液(0.2 mol/L)终止反应，于400 nm处测定吸光度值(A)，重复3次，取平均值。空白实验以缓冲液代替玉米蛋白酶解液和酶溶液，对照实验以缓冲液代替玉米蛋白酶解液。

(1)

式中：A1为添加样品和酶时吸光度；A2为将酶液换为等体积缓冲溶液时吸光度；A3为将样品替换为等体积ddH20吸光度；A0为将样品以等体积ddH20替代，酶液以缓冲溶液替代测定空白组吸光度。

1.3.5.2 抗氧化活性测定

DPPH 自由基清除率的测定：根据文献[18]并进行适当修改：取2 mL玉米蛋白酶解液(2 mg/mL)，加入2 mL DPPH无水乙醇溶液(0.1 mmol/L)，混合均匀，避光反应30 min，在517 nm处测其吸光值(Ai)；取2 mL玉米蛋白酶解液于试管中,加入2 mL无水乙醇,在517 nm处测其吸光值(Aj)；取2 mL DPPH 无水乙醇溶液(0.1 mmol/L)和2 mL无水乙醇反应作为对比,在517 nm处测其吸光值(A0)。样品对DPPH自由基的清除率K按式(2)计算。

(2)

还原力的测定：参照文献[19]并进行适当修改。取2 mL玉米蛋白酶解液(2 mg/mL)，分别加入2 mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6，0.2 mol/L)，2 mL质量分数为1%的铁氰化钾溶液，混匀，在50℃水浴下保温20 min，再加入2 mL质量分数10%的三氯乙酸(TCA)溶液，震荡摇匀后以4 000 r/min离心10 min。取离心后上清液2 mL，加入2 mL去离子水和0.4 mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液，震荡摇匀后在50 ℃水浴下保温10 min，波长700 nm下测定吸光值。以去离子水代替样品重复操作作为空白。

清除羟基自由基(·OH)活性的测定，根据文献[20]并进行适当修改。取2 mL玉米蛋白酶解液(2 mg/mL)，依次加入2 mL FeSO4(6 mmol/L)、H2O2(6 mmol/L)，混匀静置10 min，加入2 mL水杨酸(6 mmol/L)混匀，静置30 min，在510 nm处测定吸光值(Ai)。用去离子水代替水杨酸重复操作，测定510 nm处的吸光值(Aj)，用去离子水代替样品重复以上操作测定510 nm处的吸光值(A0)。0.01mg/mL的VC溶液作为对照。样品对羟基自由基的清除率Y按式(3)计算。

(3)

1.4 数据处理与分析

所有实验均设置3组平行，数据用平均值±标准差表示，采用SPSS Statistics 25和Excel 2020对数据进行显著性分析及相关性分析，采用Design Expert 11进行响应面分析，以P<0.05表示差异显著，使用Origin 2019b进行绘图。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶选择

由于不同蛋白酶的酶切位点及作用方式不同[21,22]，其玉米蛋白酶解产物对α-葡萄糖苷酶抑制率强弱也有很大的差异，小分子肽在被人体吸收后才具有一定的生理活性，要富集小分子肽，就必须基于一定的水解程度。本实验参考李佳等[23]的研究，选取4种经验证效果较好的蛋白酶分别对玉米黄粉进行水解。由图1可以看出，各种酶的水解液都有一定的α-葡萄糖苷酶抑制效果，且具有显著的差异性(P<0.05)，木瓜蛋白酶水解液的抑制率只有17.61%，而碱性蛋白酶水解液则高达51.34%。这是由于每种酶作用的位点不同，生成肽段的结构和数量不同。风味蛋白酶主要通过内切蛋白酶切断多肽内部的肽键，形成短链肽[24]。碱性蛋白酶水解具有芳香族或疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等)的羧基侧链，水解能力较强。筛选得到效果较好的碱性蛋白酶和风味蛋白酶，用于优化制备高活性的玉米降血糖肽。

图1 不同蛋白酶水解物对α-葡萄糖苷酶抑制率

2.2 双酶水解工艺优化

2.2.1 碱性蛋白酶水解条件优化

采用100 g/L的底物含量，以温度60 ℃、pH 8.5、加酶质量分数2%和反应时间2 h为初始酶解条件进行单因素实验[25]，考察温度、pH、加酶量和时间对玉米蛋白水解物对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响。而后缩小各因素的变化水平进行L9(34)正交实验，确定适宜酶解条件。此外，可溶蛋白含量的测定可反映玉米蛋白粉在酶解过程中的得率，在实际加工中具有重要的经济意义。而水解度可反映玉米蛋白粉的水解情况，探讨其与α-葡萄糖苷酶抑制活性与可溶蛋白含量之间的关系具有重要意义，因此在条件优化过程中测定了玉米蛋白水解产物的可溶蛋白含量和水解度。由图2可知，碱性蛋白酶是一种内切肽酶，优先水解疏水性且分子质量较大的蛋白质或肽，而玉米蛋白中含有较多的疏水性氨基酸。反应时间在2 h时，蛋白水解物的α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值为44.58%，2 h后，酶解过程中有活性部位的端基氨基酸被切断，活性肽链长度缩短，氨基酸组成发生了改变，从而使得抑制率明显降低[26]。加酶量为1.5%时抑制率达到37.17%，且此时酶解产物中的可溶蛋白含量以及水解度均趋于平缓，这说明在酶的高速催化下，玉米蛋白中的肽段被快速水解下来，而随着酶解反应的进行，可作用的肽键减少[27]。

pH对酶活力的影响在过酸或过碱都会造成酶本身空间结构的破坏，甚至引起酶失活，另外，pH值还可能改变底物的解离状态，影响底物和酶的结合，影响水解效果，从而造成酶活力的下降[28]，pH为8.5时，水解物的α-葡萄糖苷酶抑制率达到最高52.05%。温度50 ℃时α-葡萄糖苷酶抑制率达到62.45%，这是由于酶在最适温度反应活性最强，超过酶的最适温度后，酶分子的空间结构由于温度的增加而发生改变，导致酶活性减弱或丧失，从而影响催化效果[29]。

图2 碱性蛋白酶单因素实验结果

2.2.2 碱性蛋白酶水解玉米蛋白的正交实验

碱性蛋白酶正交实验因素水平和结果分别见表2、3，方差分析见表4。

表2 正交因素水平表

表3 碱性蛋白酶水解玉米蛋白的正交实验设计及结果

由表3综合考虑各方面因素，本研究选择最佳组合为A2B3C2D2，即酶解温度50 ℃、pH 8.5、加酶量2%(V/m)和反应时间2 h。在此组合条件下，玉米蛋白水解液的α-葡萄糖苷酶抑制率为75.94%，可溶蛋白含量为66.23 mg/mL。由表4可知，各因素对水解物α-葡萄糖苷酶抑制率及水解度、可溶蛋白含量均具有显著性影响。

表4 方差分析表

2.2.3 风味蛋白酶水解条件优化

采用100 g/L的底物含量，以温度50 ℃、pH 6、质量分数4.5%100 g/L和反应时间3 h为初始酶解条件[25]，考察温度、pH、加酶量和时间对玉米蛋白水解物对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响。而后在单因素实验的基础上进行L9(34)正交实验，确定风味蛋白酶水解玉米蛋白制备降血糖蛋白水解物的适宜条件。由图3可知，反应时间在3 h时，蛋白水解物的α-葡萄糖苷酶抑制率最大。随酶解时间的延长，抑制率呈下降趋势，可能是蛋白酶酶解时间过长，活性部位的末端氨基酸被切断，活性肽链长度缩短，氨基酸组成发生了改变[30]，导致水解液的α-葡萄糖苷酶抑制率明显降低。不同加酶量下，当酶解达到饱和状态时反应速率由底物质量分数决定，继续增加酶量对水解度的影响不大[31]，当质量分数为5.5%时，蛋白酶解物α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值为50.21%。温度在50 ℃时，α-葡萄糖苷酶抑制率达到59.20%。这是因为在酶的最适温度反应活性最强，超过酶的最适温度后，酶分子空间结构由于温度的升高而发生改变，导致酶活性减弱或丧失，影响催化效果。pH对酶活力的影响表现在过酸或过碱都会造成酶本身空间结构的破坏[32，33]，导致酶活降低，当pH为6.5时，水解物的 α-葡萄糖苷酶抑制率达到最高值37.50%。

图3 风味蛋白酶单因素实验结果

表5 正交因素水平表

由表6所示，综合考虑各方面因素，本研究选择最佳组合为A3B2C2D2，即酶解温度为50 ℃、pH 6.5、质量分数5.5%和反应时间4 h。在此组合条件下，玉米蛋白水解液α-葡萄糖苷酶抑制率为61.29%，可溶蛋白含量为36.43 mg/mL。由表7可知，各因素对水解物α-葡萄糖苷酶抑制率及水解度、可溶蛋白含量均具有显著性影响。

表6 风味蛋白酶水解玉米蛋白的正交实验设计及结果

表7 方差分析表

2.2.4 碱性蛋白酶和风味蛋白酶协同水解玉米蛋白条件

通过改变2种蛋白酶的作用顺序对玉米蛋白进行水解，考察酶解顺序对酶解效果的影响。在单因素得出的适宜条件基础上，采用双酶复合水解玉米蛋白的方法制备降血糖活性更高的蛋白水解物。从图4可以看出，双酶协同水解玉米蛋白与单酶水解的情况相比，蛋白水解物的水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率均有提高。这是因为双酶对玉米蛋白水解比单酶更加充分，增加了蛋白酶的作用位点，玉米蛋白水解更加彻底使得更多具有活性的小分子多肽游离释放出来。酶解210 min后风味+碱性蛋白酶α-葡萄糖苷酶抑制率及水解度开始提高，显著高于碱性+风味蛋白酶，得到了较强α-葡萄糖苷酶抑制率的玉米蛋白水解物。这是因为风味蛋白酶是外切蛋白酶，酶解后加入碱性蛋白酶是内切蛋白酶，其对疏水性肽键具有优先水解作用，因此可水解出具有疏水性氨基酸末端的肽段，玉米蛋白在其作用下继续水解，致使肽键更加充分断裂[34]，从而使得肽链暴露出降血糖的氨基酸集团，使得玉米蛋白水解物α-葡萄糖苷酶抑制效果增强。

图4 不同加酶顺序对玉米蛋白酶解物降血糖活性的影响

2.3 超滤分离组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性

利用最佳水解条件风味-碱性蛋白酶制备的酶解产物经超滤分离的4个不同相对分子质量肽组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性如图5所示。风味+碱性蛋白酶酶解玉米黄粉的水解物中的降血糖抑制肽多为小分子质量短肽，对水解液进行分级处理，获得α-葡萄糖苷酶抑制率较高的组分。在超滤过程中可溶蛋白被超滤膜截留所以导致超滤组分中可溶蛋白含量逐级减少。超滤获得的四个肽组分与玉米蛋白酶解物相比均表现出α-葡萄糖苷酶抑制活性，<1 ku组分显示出较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

注：对照为风味-碱性蛋白酶水解物。图5 不同超滤组分的α-葡萄糖苷酶抑制率

2.4 超滤分离组分的抗氧化性

利用最佳水解条件风味-碱性蛋白酶制备的酶解产物，对经超滤分离的4个不同超滤肽组分进行抗氧化活性测定，如图6所示。超滤后的玉米蛋白酶解液四个肽组分都具有抗氧化活性，<1 ku组分的抗氧化活性显著高于其他组分(P<0.05)。其中<1 ku组分的还原力高达(0.181±0.003)，羟自由基清除率达到(76.72±1.48)%，DPPH自由基清除率达到(52.56±1.62)%。研究结果表明风味+碱性蛋白酶酶解玉米黄粉的水解物中的降血糖抑制肽同时也具有抗氧化活性，且1 ku以下组分抗氧化活性较好[35，36]，这说明具有活性的多肽主要集中在小分子多肽中[37]。

图6 不同超滤组分的抗氧化活性

3 结论

以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，对碱性和风味蛋白酶协同水解玉米蛋白的条件进行研究。研究结果表明碱性蛋白酶最适条件为：酶解温度50 ℃、pH 8.5、质量分数2%和反应时间2 h。风味蛋白酶最适条件为：酶解温度50 ℃、pH 6.5、质量分数5.5%和反应时间4 h。优化加酶顺序得到风味蛋白酶+碱性蛋白酶所得水解物的α-葡萄糖苷酶抑制率高达81.38%。水解物经超滤后被分为>10、10～5、5～1、<1 ku 4个组分，对分离组分测定α-葡萄糖苷酶抑制率，发现<1 ku组分的α-葡萄糖苷酶抑制率最高，为90.87%，且具有较高的抗氧化活性。