4种拟除虫菊酯类农药对海带生长及叶绿素a含量的影响

郑惠东

(福建省水产研究所、福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

拟除虫菊酯类农药是上世纪七十年代人工合成的高效、低毒、广谱杀虫剂。面世以来，发展迅速，种类数不断增加，目前已商品化的拟除虫菊酯类农药达60多种，依其化学结构的不同，可分为不含α-氰基的Ⅰ型(以联苯菊酯、胺菊酯等为代表)和含α-氰基的Ⅱ型(以溴氰菊酯、氰戊菊酯等为代表)，广泛应用于农、林业的病虫害防治，效果显著。由于拟除虫菊酯类农药的大量使用，使得拟除虫菊酯类农药可通过河流和地表径流等途径进入河口和海湾[1]。近年来，在水产养殖业，拟除虫菊酯类农药也被用于池塘养殖、贝类滩涂养殖清除敌害生物[2]、病虫害防治[3]等，导致近岸海域拟除虫菊酯类农药污染逐年加剧。在水产养殖过程中，因未能掌握其对不同种类养殖生物的毒性和安全用量，常常导致渔业污染事故发生。

国内外关于菊酯类农药对水生生物的急性毒性、亚急性毒性及其作用机理进行了较多的研究，但主要集中于鱼类、甲壳类、贝类等方面[4-8]。拟除虫菊酯类农药对微型藻类生长的毒性效应研究也有一些报道，如氯氰菊酯对斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)生长的影响及其生理生化效应研究[9]，以及拟除虫菊酯类农药灭扫利对3种海水单胞藻生长的影响研究[10]。目前，拟除虫菊酯类农药对大型藻类的毒性效应研究鲜见报道。

海带(Laminariajaponica)，又名昆布，是多年生大型食用藻类，营养价值和经济价值均较高，是我国产量最大的大型经济藻类，2018年产量达1.52×106t，占全国藻类总产量的64.9%，主产区为福建、山东、辽宁等地[11]。本研究选取海带作为研究对象，开展溴氰菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯、醚菊酯等4种拟除虫菊酯类农药对其生长、半抑制效应浓度(EC50)及叶绿素a(Chl a)含量影响研究，掌握其在拟除虫菊酯类农药暴露下的生长情况，探讨拟除虫菊酯类农药对大型藻类的毒性效应，可为指导水产养殖科学用药和安全生产以及保护海洋渔业生态环境提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验海带取自福建省漳州市龙海区镇海角海带养殖区。实验海带个体均匀、体表无破损，正式实验前在60 m2水泥池中暂养7 d，用砂滤海水流水培育。实验海带初始体长为(35.0±2.3) cm，其体重为(5.50±0.69) g。

溴氰菊酯农药为山东邹平农药有限公司生产，农药生产批准号为XK13-200-00208，有效成份含量为25 g/dm3(乳油)。联苯菊酯农药为江苏皇马农化有限公司生产，农药生产批准号为HNP32017-A2706，有效成份含量为25 g/dm3(乳油)。氰戊菊酯农药为上海悦联化工有限公司生产，农药生产批准号为HK13-200-00705，有效成份含量为20%(乳油)。醚菊酯农药为广州植物龙生物技术有限公司生产，农药生产批准号为HNP44081-D3427，有效成份含量为100 g/dm3(悬浮剂)。

1.2 实验条件

实验用水为砂滤海水。实验期间光照强度为5 000～10 000 lx，水温范围为18.5～20.5 ℃，盐度范围为30.0～31.5，pH值范围为7.95～8.12，溶解氧含量范围为5.96～6.55 mg/dm3。实验容器为长方形玻璃水族箱，容积为80 L。

1.3 毒性实验方法

在预实验的基础上，选取1、5、10、50、100、500 μg/dm36个梯度对海带进行体外半静置染毒，并设空白对照组，各组均设3个平行，每日用相同浓度药水换水1次。各实验组海带数量为10株，每株用棉绳绑在叶状体基部，悬挂于水族箱上方支架上，使整株海带叶状体浸没于实验水体内。分别于实验后第0、2、4、8、12、16、20、24 d将实验海带取出，用于生物学测定和Chl a含量测定。生物学测定时将实验海带取出，悬挂于架子上,阴干10 min，用滤纸吸干海带表面水份，称量体重、体长。取海带叶状体中部部位进行Chl a含量测定。

1.4 数据处理

海带增长率计算公式如下：

(1)

式(1)中：Pt为在t时段海带的增长率(%)，W0为实验初次测定的海带的重量(g)，Wt为在t时段测定的海带的重量(g)。

海带生长抑制率或促进率计算公式如下：

(2)

式(2)中：Yt为在t时段海带生长的抑制率或促进率(%)，Wp0为实验组初次测定的海带重量(g)，Wpt为实验组t时段测定的海带重量(g)；Wc0为对照组初次测定的海带重量(g)，Wct为对照组t时段测定的海带重量(g)，Chl a抑制率或促进率计算公式参照式(2)。

建立海带生长抑制率的概率单位(Y)和拟除虫菊酯类农药浓度的自然对数(X)的线性方程，求解抑制率为50%的浓度为海带的半抑制浓度值。将获得的数据用SPSS 19.0统计软件和Excel 2017软件进行单因素方差分析和回归分析，检验其显著性和相关性。

2 结果与讨论

2.1 4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的影响

不同浓度的拟除虫菊酯类农药对海带生长的影响实验见图1。由图1可知，低浓度(1 μg/dm3)组4种拟除虫菊酯类农药对海带生长均具有促进作用(P<0.05)，其中促进作用最强的为联苯菊酯，增长率为对照组的1.48倍；其次为氰戊菊酯，增长率为对照组的1.44倍；促进率最低的为溴氰菊酯，增长率为对照组的1.10倍。低浓度(5 μg/dm3)组溴氰菊酯和醚菊酯海带的增长率与对照组相比均无明显差异(P>0.05)；联苯菊酯对海带生长呈前期促进、后期抑制的作用，暴露4～12 d时，海带增重量为对照组的1.03～1.19倍；暴露16～20 d时，其增重量降为对照组的80%～85%；而氰戊菊酯对海带的生长具有显著的抑制作用(P<0.05)，暴露2～24 d时，海带的增长率则为对照组的48%～63%。中等浓度(10、50 μg/dm3)溴氰菊酯和联苯菊酯对海带生长均为初期(2～4 d)促进，随后促进作用力减弱，抑制作用逐渐增强，其中联苯菊酯后期对海带生长抑制作用更为明显，50 μg/dm3组海带增长率为对照组的47%，明显低于溴氰菊酯(增长率为78%)。氰戊菊酯和醚菊酯对海带生长具有明显抑制作用，暴露24 d时，50 μg/dm3组海带的增长率均不到对照组的60%，生长受到中度抑制。高浓度(100、500 μg/dm3)4种拟除虫菊酯类农药对海带生长具有显著抑制作用(P<0.01)，且浓度越高，暴露时间越长，抑制作用越大。其中氰戊菊酯和醚菊酯对海带生长抑制作用尤为明显，500 μg/dm3组海带仅暴露4～6 d时，整条海带叶状体出现糜烂，颜色由褐色变为绿色、白色，海带全部死亡。

总体上看，4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的影响均呈低浓度促进、高浓度抑制作用，且随着浓度升高和暴露时间延长，呈促进作用减弱，抑制作用增强之势。

图1 4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的影响Fig.1 Effects of 4 pyrethroid pesticides on the growth of Laminaria japonica

2.2 4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的影响程度比较

根据实验期间4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的促进率和抑制率，比较4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的影响程度。由表1可以看出4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的抑制作用大小依次为：氰戊菊酯≈醚菊酯>联苯菊酯>溴氰菊酯，促进作用大小依次为：氰戊菊酯>联苯菊酯≈溴氰菊酯>醚菊酯。

表1 4种拟除虫菊酯类农药对海带生长影响的比较Tab.1 Comparison of the effects of 4 pyrethroid pesticides on the growth of Laminaria japonica

2.3 4种拟除虫菊酯类农药对海带的半抑制效应浓度

如表2所示，4种拟除虫菊酯类农药对海带的24 d半抑制效应浓度为溴氰菊酯>联苯菊酯>醚菊酯>氰戊菊酯，结合上节研究结果，4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的抑制作用越大，24 d半抑制效应浓度越小。

表2 4种拟除虫菊酯类农药对海带的半抑制效应浓度值Tab.2 EC50 values of 4 pyrethroid pesticides to Laminaria japonica

2.4 4种拟除虫菊酯类农药对海带体内Chl a含量的影响

4种拟除虫菊酯类农药对海带体内Chl a含量的影响如图2所示。实验期间，各实验组海带体内Chl a含量呈先升后降之势。低浓度(1、5 μg/dm3)组海带体内Chl a含量显著升高，从与对照组相近的水平分别上升为对照组的1.14、1.19倍，具有显著的促进作用(P<0.05)。溴氰菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯和醚菊酯中浓度(10、50 μg/dm3)组海带体内Chl a含量受到程度不同的抑制，浓度为10 μg/dm3时各组海带体内Chl a含量均出现抑制现象，但与对照组相比差异不显著(P>0.05)；浓度为50 μg/dm3时，海带体内Chl a含量分别为对照组的78.7%～88.9%、81.5%～85.1%、64.7%～81.3%和54.5%～84.1%，具有显著的抑制作用(P<0.05)。溴氰菊酯和联苯菊酯高浓度(100、500 μg/dm3)组海带体内Chl a含量受到中度抑制，海带体内Chl a含量分别为对照组的53.9%～75.2%和49.2%～79.1%，差异显著(P<0.05)，且随着浓度升高，抑制作用呈增强之势。氰戊菊酯和醚菊酯高浓度(100、500 μg/dm3)组海带体内Chl a含量受到重度抑制，差异极显著(P<0.01)，其中500 μg/dm3时，氰戊菊酯和醚菊酯皆因海带叶状体严重糜烂而实验中止。由此表明，4种拟除虫菊酯农药对海带体内Chl a含量的影响均呈低浓度促进、高浓度抑制作用，且随着浓度升高和暴露时间的延长，抑制作用呈增强之势，促进作用呈减弱之势，存在一定的浓度效应和时间效应。

图2 4种拟除虫菊酯类农药对海带体内Chl a含量的影响Fig.2 Effects of 4 pyrethroid pesticides on Chl a content of Laminaria japonica

2.5 4种拟除虫菊酯类农药对海带体内Chl a含量的影响程度比较

根据实验期间4种拟除虫菊酯类农药对海带体内Chl a含量积累的促进率和抑制率，比较4种拟除虫菊酯类农药对海带光合作用的影响程度。由表3可看出，4种拟除虫菊酯类农药对海带体内Chl a含量的抑制作用大小为醚菊酯>氰戊菊酯>联苯菊酯>溴氰菊酯，促进作用大小为溴氰菊酯>联苯菊酯>醚菊酯>氰戊菊酯。

表3 4种拟除虫菊酯类农药对海带Chl a含量影响的比较Tab.3 Comparison of the effects of 4 pesticides on Chl a content of Laminaria japonica

2.6 讨论

拟除虫菊酯类农药对海洋大型藻类的毒性效应研究鲜见报道，仅王朝晖等(2010)研究了氯氰菊酯对龙须菜(Gracilarialemaneiformis)的胁迫影响，发现浓度为50 μg/dm3时仍对龙须菜生长具有显著促进作用，100 μg/dm3以上的浓度才会对龙须菜生长产生明显抑制作用[1]。本研究表明，海带暴露于不同浓度的4种拟除虫菊酯类农药，浓度为1 μg/dm3时溴氰菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯、醚菊酯对海带生长均表现为促进作用，浓度为5 μg/dm3时部分农药如氰戊菊酯、联苯菊酯就对海带生长开始表现出抑制作用。相比龙须菜而言，拟除虫菊酯类农药在较低浓度时(5 μg/dm3)就对海带生长表现出抑制作用，50 μg/dm3以上则表现出较强抑制作用。可见，拟除虫菊酯类农药对海带生长的抑制作用远大于龙须菜。这可能与不同藻类对农药的敏感性不同有关，亦或海带叶状体表面积比龙须菜大得多，乳油或悬浮状的拟除虫菊酯类农药投入水体后，较易沉降粘附于叶状体表面，从而导致对海带毒性效应更加明显。总体上，拟除虫菊酯类农药对海带和龙须菜的生长均存在低浓度促进、高浓度抑制现象，王朝辉(2012)、李春宇等(2018)等对微藻的研究也存在类似现象[9-10]。已有研究表明，低浓度有毒物质对藻类生长的增益现象属于生物对毒物的“兴奋效应”[1]，低浓度暴露下，污染物增加了藻细胞内部分酶的活性[12]，促进了藻类的代谢和生物降解[13-14]，从而促进其生长；而当污染物浓度超过生物的耐受限度时，则会产生毒害作用，并抑制藻类生长[1]。

叶绿体是植物细胞生命活动中十分重要的能量转换细胞器，为细胞进行正常生命活动提供所必需的能量[15]。Chl a是所有光能自养生物共同拥有的光合色素，与植物的生长密切相关。已有研究表明，农药能改变藻类Chl a的含量，从而影响光合作用。例如，浓度为2 mg/dm3和4 mg/dm3的杀草丹可使灰色念珠藻(Nostocmuscorum) Chl a的含量分别下降56%和74%，进而抑制光合作用[16]；敌稗通过抑制喜钙念珠藻(Nostoccalcicola)Chl a的合成，进而抑制其光合作用[17]；在氯氰菊酯胁迫下，低浓度氯氰菊酯能使龙须菜体内的Chl a含量增加，从而保证胁迫条件下藻体光合作用的需求，并且Chl a含量变化表现出低浓度促进、高浓度抑制的现象[1]。本研究表明，实验前、中期，低浓度(1 μg/dm3)的4种拟除虫菊酯类农药均能使海带体内的Chl a含量明显增加，表现出明显促进作用。但后期低浓度组Chl a含量逐渐恢复正常，表明在染毒一段时间后，藻体对低浓度农药已逐步适应，促进作用减弱。低浓度下农药对藻类的促进作用可能与农药被藻类吸收后藻体内叶绿体酶活性受到诱导，进而促进叶绿体的合成及植物的光合作用有关[1]。相反，高浓度(大于100 μg/dm3)组海带体内的Chl a含量明显下降，表现出较强抑制作用。农药对藻类光合作用抑制机理较为复杂，Mohapatra等(1997)研究表明乐果能改变类囊体膜的流动性，抑制光合作用电子传递[18]。Sáenz等(1997)认为草甘膦抑制叶绿素前体的合成，从而影响光合作用[19]。王朝晖等认为，高浓度的拟除虫菊酯类农药暴露可能干扰色素的合成，并导致色素的降解，从而使Chl a含量急剧下降[1]。另外，染毒一段时间后，高浓度组海带藻体的颜色由褐色变为绿色，甚至退为白色，导致藻体Chl a含量一直处于低位，无法恢复到正常水平，这可能与农药浓度高于藻类可承受限度后，藻体内正常的生命活动如褐藻蛋白等的合成受到干扰破坏有关[20-21]。

4种拟除虫菊酯类农药对海带体内Chl a含量的影响程度明显不同，其中抑制作用大小为醚菊酯>氰戊菊酯>联苯菊酯>溴氰菊酯。醚菊酯对海带的光合作用的抑制效应最高，这与醚菊酯农药为悬浮剂，投入水体后，悬浮于表、中层，水体浑浊呈乳白色，且不断沉降粘附于海带叶状体表面阻碍海带的光合作用有关。因此，作为低毒农药的醚菊酯对海带生长的毒害可能是物理和化学因素共同作用的结果。

拟除虫菊酯类农药属神经毒剂，对鱼、虾等水生动物具有极高的毒性，如联苯菊酯对真鲷(Pagrusmajor)的96 hLC50为0.84 μg/dm3[22]，溴氰菊酯对远海梭子蟹(Portunuspelagicus)和日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicas)的96 hLC50分别为0.11、0.14 μg/dm3[23]，氰戊菊酯对日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicas)的96 hLC50为0.31 μg/dm3[24]。已有研究表明，在海水养殖区，溴氰菊酯作为病害防治的极限浓度为5 μg/dm3[25]。因此，在开放海域使用拟除虫菊酯类农药清除敌害生物具有较高的生态风险，应避免使用。拟除虫菊酯类农药对藻类毒性较低，其毒性效应无法用半致死浓度来表示，只能根据农药对藻类生长的抑制率来计算半抑制效应浓度。本研究表明，4种拟除虫菊酯类农药对海带的半抑制效应浓度差异显著，其中毒性最低的溴氰菊酯半抑制效应浓度分别为氰戊菊酯和醚菊酯的7.7倍和5.6倍。氰戊菊酯和醚菊酯即使在低浓度(5 μg/dm3)下对海带的生长也有明显抑制作用，其毒性明显高于联苯菊酯和溴氰菊酯。因此，即使在室内或池塘使用拟除虫菊酯类农药进行病害防治或杀灭敌害生物，也应严格甄选拟除虫菊酯类农药的品种，并掌握其安全用量，使用浓度建议不高于5 μg/dm3。

3 结论

(1)4种拟除虫菊酯类农药对海带生长的影响均呈低浓度促进、高浓度抑制作用，且随着浓度升高和暴露时间延长，呈促进作用减弱，抑制作用增强之势。对海带的半抑制效应浓度分别为82.4、53.0、10.7、14.6 μg/dm3，抑制作用大小为氰戊菊酯≈醚菊酯>联苯菊酯>溴氰菊酯。

(2)4种拟除虫菊酯类农药对海带体内Chl a含量的影响均呈低浓度促进、高浓度抑制作用，且随着浓度升高和暴露时间的延长，抑制作用呈增强之势，促进作用呈减弱之势，存在一定的浓度效应和时间效应。对海带体内Chl a含量的抑制作用大小为醚菊酯>氰戊菊酯>联苯菊酯>溴氰菊酯，促进作用大小为溴氰菊酯>联苯菊酯>醚菊酯>氰戊菊酯。

(3)在开放海域使用拟除虫菊酯类农药清除敌害生物具有较高的生态风险，应避免使用。在室内或池塘中使用拟除虫菊酯类农药进行病害防治或杀灭敌害生物时，也应严格甄选拟除虫菊酯类农药的品种，并掌握其安全用量，使用浓度建议不高于5 μg/dm3。

致谢：福建省水产研究所钟硕良、许贻斌、郑盛华、陈宇锋、姜双城、罗冬莲等参与了实验设计和样品测定,在此一并感谢！