基因编辑技术在植物育种中的应用

●高 珊（辽源市农业科学院 吉林 辽源 136200）

近年来，越来越多的新技术被应用在农作物遗传改良种，这些技术推动了新品种的研发，加快了品种改良的进程，同时提高了改良的目的性。基因编辑就是其中应用前景最为广泛的技术之一，是通过序列特异性核酸酶进行精确定位，对目的基因片段进行插入或剪切新基因片段使基因沉默或同源重组，从而让目的性状得到表达。

1 基因编辑技术

1.1 锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）

该项技术是第1代基因组编辑技术。每个ZFN单体都是由FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域融合锌指蛋白结构域而成。锌指蛋白决定锌指核酸酶的特异性。

1.2 转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）

这项技术已逐步替代ZFN技术，TALEN能特异性识别靶标DNA序列，具有较强的设计性，比ZFN技术具有更好的应用潜力。

1.3 规律性重复短回文序列簇（CRISPR/Cas）

规律性重复短回文序列簇（CRISPR/Cas）系统是古细菌和细菌在抵御外来病毒和质粒过程中产生的特异性免疫系统。CRISPR/Cas系统的基因座由反式激活RNA基因、Cas家族蛋白和CRISPR序列3部分组成。因其具有简单、快速、高效等特点，已被应用于艾滋病、阿尔兹海默病等疾病的治疗中。

锌指核酸酶系统由可以特异性识别DNA双链的锌指结构域和FokⅠ核酸酶结构域两部分构成，因其核酸酶设计复杂、特异性较差、易脱靶逐渐被取代。

转录激活因子样效应物核酸酶系统是由TALEN效应蛋白的DNA结合域和FokⅠ核酸酶结构域两部分组成，其特异性得到了一定的改善，但是由于所用载体太大，仍然没有得到很好的应用。

成簇的规律间隔的短回文重复序列系统由CRISPR序列元件和Cas基因家族组成。

CRISPR/Cas系 统 有3种 类 型，TypeⅠ 和TypeⅢ系统存在于细菌和古细菌中，TypeⅡ系统仅存在于细菌中，其中Ⅱ型只需要1个Cas蛋白就可以完成对靶位点的切割，而Ⅰ型和Ⅲ型都需要多个Cas蛋白才能完成对靶标位点的切割。因此Ⅱ型系统已成为最常用的基因编辑系统。2013年Cong等[1]首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对人类及小鼠细胞进行定点基因敲除。此后，该技术逐渐应用于果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻、小麦、玉米的体外培养细胞中。

2 CRISPR/Cas系统的工作机理

CRISPR/Cas工作机理可分为3个阶段，主要是适应、表达和干扰，第一阶段是新的间隔序列的获得，第二阶段是这些新获得的间隔重复序列被转录为前体CRISPR RNA（Pre-crRNA）。然后在核酸内切酶的作用下形成成熟的crRNA[2-3]，第三阶段是crRNA与tracrRNA的复合物在Cas蛋白的作用下切割外源DNA。

3 CRISPR/Cas9系统在作物育种中的应用

3.1 在水稻育种中的应用

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，并因其遗传转化更易操作，已成为重要的模式植物。因此，近年来利用CRISPR/Cas9技术对水稻品质、产量及抗性相关的研究被广泛报道。Zhou等[4]应用CRISPR/Cas9系统让水稻温敏型雄性不育基因TMS5发生特异性突变，从而开发出11个无转基因成分的改良TGMS品系，其具有巨大育种潜力。Shen等[5]应用CRISPR/Cas9系统编辑粒型基因GS3和穗粒数基因Gnla，导致基因突变失活，以此获得粒长、穗粒数多的株系，但其产量显著下降。Miao等[6]应用CRISPR/Cas9系统对水稻分蘖基因LAZY1进行编辑，使其发生双等位变异，研究发现T1代转基因幼苗的分蘖数量显著增多。Wang等[7]通过应用CRISPR/Cas9技术编辑稻瘟病侵染效应因子基因OSERF922，使水稻抗稻瘟病能力增加。Wang等[8]利用CRISPR/Cas9技术编辑调控水稻产量千粒重的基因TGW6，实验表明T1代纯合缺失突变体千粒重明显增加。Wang等[8]对籼稻应用CRISPR/Cas9技术进行定点突变发现，最终突变体水稻产量反着粒密度均增加。Wang等[9]利用 CRISPR/Cas9技术将稻瘟病感病品种“空育131”中的OsERF922 基因定向敲除，获得的T2 纯合突变系对稻瘟病菌的抗性较野生型明显提高。

3.2 在玉米育种中的应用

玉米既是世界第一大粮食作物之一，同时也是化工、饲料等领域的原料。Liang等[10]率先建立了玉米的TALENs和CRISPR/Cas9基因定向编辑系统，并比较了TALENs和CRISPR/Cas9诱导ZmIpk同一位点的突变效率，结果发现在玉米原生质体中CRISPR/Cas9的诱导突变率较TALENs高4%。Svitashev等[11]利用CRISPR/Cas9技术敲除玉米的ALS2基因，获得了抗磺胺脲成分除草剂的玉米植株。杜邦先锋公司利用CRISPR/Cas9系统，将糯玉米性状引入性状优良的杂交种中，从而解决了糯玉米地低产的问题。同时也避免了回交育种等繁琐工作。美国杜邦先锋公司将玉米ALS2编码区的第165位脯氨酸利用CRISPR/Cas9技术突变成丝氨酸，得到抗氯磺隆的玉米突变体。

3.3 在小麦育种中的应用

小麦是异源多倍体植物，其基因组庞大。常规的杂交育种方法局限性较多，故新型的基因编辑技术更适合于小麦的研究。Zhang等[12]应用CRISPR/Cas9技术对调控小麦粒重、粒长的基因TaGASR7和穗密度基因TaDEP1进行定点编辑，研究结果表明，TaGASR7纯合突变体粒重明显增加，TaDEP1纯合突变体明显变短。Shan等[13]应用CRISPR/Cas9技术诱导面包小麦原生质体中MLO基因发生突变。Zheng等[14]利用CRISPR/Cas9获得了可以同时敲出三个同源基因的对白粉病有较强抗性的突变体。Li等[15]编辑小麦的基因转化其原生质体研究表明突变率达到28.5%。

4 展望

目前，全球已经有很多转基因作物，大豆、玉米、棉花等已在多个国家广泛种植，但转基因作物的生物安全性问题一直受到关注。国际上对基因编辑作物是否属于转基因生物还没有统一定论。目前，我国对基因编辑作物的监督管理标准还没有明确规定，因此需要尽快出台相关的政策以规范基因编辑育种。

传统的育种方法需要投入大量的人力和时间才能获得星状优良的品种，而现在通过CRISPR/Cas9技术就可以直接有效地获得优良性状品种，但CRISPR/Cas9技术存在一些技术方面的问题，如脱靶效应和如何构建通用载体等。虽然CRISPR/Cas9技术还有一些不足，但随着科技的进步，相信其在未来转基因研究中具有巨大潜力。