细胞焦亡的作用机制及其在肺纤维化中的研究进展

茹美华 刘迎博 李建强，2

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一类病因不明的的慢性进行性肺间质疾病，患病人数较多，疾病预后相对较差。细胞焦亡(pyroptosis)是近来发现的一种由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)介导的程序性细胞死亡方式。很多研究表明，细胞焦亡在呼吸系统疾病尤其是肺纤维化的发病中起着重要作用，炎性小体等相关因素可通过诱导细胞焦亡的发生参与肺纤维化的发生发展过程。本文就细胞焦亡的作用机制及其参与肺纤维化发生发展及治疗方面的相关研究进展做一综述。

细胞焦亡概述

细胞死亡的方式主要分为两大类，即程序性死亡和非程序性死亡，其中细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一种由基因调控的细胞自主死亡方式，主要包括细胞凋亡(apoptosis)、坏死性凋亡(necroptosis)、细胞焦亡(pyroptosis)、铁死亡(ferroptosis)、自噬(autophagy)和胞葬(efferocytosis)[1]。非程序性死亡主要指细胞坏死。

细胞焦亡的信号通路主要分为经典通路和非经典通路，其中经典的细胞焦亡通路由Caspase-1介导，而非经典通路由Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11介导。最初Hilbi[2]等于1997年发现在福氏志贺菌感染巨噬细胞后能引起Caspase-1依赖的程序性细胞死亡，观察发现细胞肿胀的同时细胞膜发生破裂，使得胞内物质释放进而引发炎性反应[3]，最终Cookson[4]于2001年将这种在巨噬细胞中发现的这种Caspase-1依赖的细胞死亡方式称之为细胞焦亡(pyroptosis)。细胞焦亡的特征是质膜完整性的丧失和细胞内容物及炎症因子(如IL-1β,IL-18等)的释放，最终导致细胞破裂，释放内容物，并导致天然免疫应答的进一步激活，引起一系列炎性反应[5]。

一、细胞焦亡与细胞凋亡的区别

细胞焦亡的形态学特点、发生及调控机理等均有别于凋亡等其他细胞死亡方式[6]。

1 细胞焦亡表现为明显的DNA片段化,而细胞凋亡表现为核固缩和凋亡小体的形成。2 细胞焦亡过程中涉及的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶主要包括介导经典途径的Caspase-1和非经典途径的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11[7-9]，不伴有Caspase-3和ADP-ribose聚合酶(PARP)的活化[10]。3 细胞焦亡过程中，细胞膜发生破裂，释放炎性介质，并引起炎性反应；而细胞凋亡过程中不涉及炎症反应，且细胞膜保持完整。4 细胞焦亡依赖Caspase-1活性，抑制caspase-1可以阻止细胞焦亡，但不能阻止细胞发生凋亡或坏死[6]。

二、细胞焦亡激活的经典通路

细胞焦亡的经典通路是由Caspase-1介导，其关键步骤是炎性小体的组装和Caspase-1的招募活化[11]，不仅存在于单核巨噬细胞系，还存在于树突状细胞、血管内皮细胞等其他细胞中[12-13]，参与机体的免疫反应。但Caspase-1依赖的细胞焦亡主要发生在巨噬细胞中，一个可能的解释是巨噬细胞可能表达更高水平的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性[11]，其确定性仍需进一步的细胞水平的实验证明。炎性小体是由多组蛋白质组成的复合物，主要包括模式识别受体(pattern recognitionreceptors，PRRs)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated-speck-like protein containing a CARD，ASC)及Caspase-1前体(pro-caspase-1)[14]。其中PRR的NOD样受体(NLR)可以识别PAMP和DAMP以启动经典炎性体途径，目前发现的有NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2等[15]。ASC 是一种接头蛋白，主要由N端的PYD、C端的CARD组成，PYD和CARD是同源的蛋白间相互作用结构域，在ASC的寡聚化中起着类似桥梁的作用。pro-caspase-1是效应分子，其被活化后能够特异性地作用于GSDMD蛋白。

炎性小体复合物的组装始于PRRs识别特定的刺激，刺激的类型包括病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和宿主来源的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)。当特定刺激被识别后，PRRs发生寡聚化将N端的PYD结构域与ASC蛋白同源的PYD结构域相结合，ASC再通过CARD-CARD结构域的相互作用从而募集Caspase-1，完成炎性小体的组装[16]。将Caspase-1前体(pro-Caspase-1)活化成caspase-1，后者一方面切割GSDMD蛋白，另一方面活化前体IL-1β、IL-18为有活性的IL-1β、IL-18，引起炎性物质释放，引起细胞炎症反应，这就是细胞焦亡的经典通路。

三、细胞焦亡激活的非经典通路

不依赖Caspase-1的焦亡被称为非经典焦亡途径[17-19]，细胞焦亡的非经典通路主要由Caspase-4和Caspase-5介导，在小鼠中为Caspase-11介导。细胞受到细菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)的刺激后，前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶直接与细菌脂多糖结合并被活化[20]，而不需要其他胞内受体(如NLRP3等)的介导。非经典通路中，前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的CARD直接与脂多糖的脂质A部分相互作用，引起前者显著构象重排。这些原天冬氨酸蛋白酶的构象变化导致利用其CARD寡聚，从而使自身蛋白水解的活性受到限制。与经典通路相比，Caspase-11的寡聚直接涉及CARD，而Caspase-1的CARD用于ASC结合，而不是寡聚[21-22]。寡聚后，Caspase-11在D285后自动与MEAD/A序列一起水解GSDMD[23-24]，获得了完全的蛋白水解活性。与裂解pro-IL-1β、IL-18和GSDMD的Caspase-1不同，活化的Caspase-4、5、11被认为只识别GSDMD，并在hGSDMD的D275或mGSDMD[23-24]的D276处切割，从而产生焦性孔隙，诱导细胞发生焦亡。

四、细胞焦亡的效应蛋白

Gasdermin D(GSDMD)位于8号染色体(8q24.3)，是由一个31 kDa的N端和一个22 kDa的C端通过肽链连接而成的蛋白质。2015年Shi J.等[23]研究发现DGSDMD是Caspase诱导细胞焦亡的最终效应蛋白，其可以被炎性Caspase激活，抑制GSDMD的C端结构域并释放其N端结构域，后者具有膜磷脂上膜打孔活性，可与细胞膜磷脂酰肌醇结合形成孔洞(约10～16 nm)，破坏细胞膜完整性[25]，导致水分内流，细胞肿胀、破裂。另一方面可以激活无生物活性IL-1β和IL-18的前体，使其形成具有生物活性的IL-1β和IL-18并释放至细胞外，募集炎症细胞聚集，引起炎症级联反应[26]，诱导细胞焦亡的发生。此外，其他GSDM家族成员GSDMA3、GSDMA、GSDME等也具有类似的功能。

细胞焦亡与肺纤维化

肺纤维化是一种肺间质的慢性疾病，主要是由肺泡上皮损伤引起的细胞外基质胶原蛋白沉积，从而导致肺脏的不可逆性损伤的纤维化疾病[27]。组织学表现为程序性死亡，在较小程度上，坏死细胞夹杂着增生和不典型的2型上皮细胞[28]。临床表现为进行性加重的呼吸困难及低氧血症，发病率呈不断上涨趋势，严重影响人们的健康和生活质量。

研究显示，炎性小体的启动和激活可以使肺泡上皮细胞焦亡，并能进一步诱发炎症反应及肺纤维化的进展[29]。在不同局部环境因素的刺激下，巨噬细胞可分为两种不同的极化状态：经典激活表型(M1)和交替激活表型(M2)[30]。在肺纤维化中，参与的巨噬细胞主要为M2型巨噬细胞。当外界或体内的刺激因子作用于肺细胞时，PRRs可识别刺激类型，联合ASC与Caspase-1组成炎性小体，活化Caspase-1后。活化的Caspase-1一方面切割GSDMD蛋白破坏肺细胞膜的完整性，另一方面使IL-1β和IL-18成熟与分泌，募集巨噬细胞等炎症细胞聚集，产生级联炎症反应。其中裂解的巨噬细胞不仅促使IL-1、IL18等的分泌，还会导致M2巨噬细胞分泌的转化生长因子-β(TGF-β)释放，从而促进肺成纤维化细胞的增殖和分化及肺细胞的炎症反正，参与肺纤维化的发生[31-32]。其中转化生长因子-β1(TGF-β1)可以诱导炎症反应，还可以促进肌成纤维细胞的聚集促进肺纤维化的发生。IL-18一方面参与肺纤维化的炎症过程，另一方面还与肺组织损伤后的重建过程如肺间质纤维化、血管壁增厚和上皮细胞再生等有关，这些炎性因子的释放表明细胞焦亡促进了肺纤维化的发生发展。

在博来霉素诱导的纤维化模型中，NLRP3缺陷小鼠支气管肺泡灌洗液中表达水平与对照组相比，中性粒细胞流入减少，IL-1β水平降低，小鼠炎性反应减弱，炎性细胞及炎性因子较少，纤维化标志物(TIMP-1)的水平相应降低，表明博来霉素阻止肺纤维化的进展；；而普伐他汀可作用于P2X7受体，可增强炎性小体的活化，从而增加肺纤维化的风险[33-34]。Hussain[35]等研究发现多壁碳纳米管(MWCNT)诱导初级人支气管上皮(HBE)细胞焦亡，通过激活NLRP3炎性小体导致肺泡上皮细胞焦亡，来启动肺纤维化进程。Pamela[36]等在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中发现，NLRP3缺陷小鼠支气管肺泡灌洗液中Caspase-1的激活、IL-1β生成均减少。孟潇潇等[37]通过实验证明在百草枯中毒中，可能存在KCa3.1激活促使细胞内钾离子外流，增高NEK7表达，进一步激活NLRP3炎症小体，介导肺纤维化的发生。以上这些研究表明细胞焦亡通过炎性小体形成释放炎性因子引起炎症反应，促进肺纤维化的发生发展，表明调控炎性小体尤其是NLRP3的形成可能成为治疗肺纤维化的一个突破点。但是对于其他的炎性小体的作用机制目前仍未完全明确，其在肺纤维化中的重要作用仍需进一步的积极探索。

细胞焦亡在肺纤维化治疗中的进展

吡非尼酮和尼达尼布是近期批准用于治疗肺纤维化的药物，两者均可通过抑制NLRP3炎症小体的激活和IL-1β等的分泌，抑制细胞焦亡的发生，减轻肺纤维化及肺部炎症，前者在脂多糖诱导的模型中发挥重要作用[38]，后者则在聚六亚甲基胍磷酸(PHMG-P)诱导的模型中发挥重要作用[39]。Song等[40]通过实验证明与吡非尼酮化学结构相似的氟苯尼酮可通过抑制NLRP3炎性小体的激活，降低Caspase-1和IL-1β水平，减轻肺纤维化。虽然目前的临床药物有效的改善了肺纤维化患者的生存率，但是其费用高、有一定的不良反应，也限制了这些药物在临床中的应用，因此继续开发新的药物是非常必要的。

王鹏飞[41]等通过动物实验发现黄芪甲苷可以抑制Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平，抑制细胞焦亡过程，显著改善了BLM诱导的小鼠肺纤维化。此外，通过细胞实验证明，Caspase-1抑制剂YVAD具有缓解肺纤维化的能力，并可逆转肺动脉高压引起的肺纤维化[23, 42-43]。Tang等[44]发现虎杖苷在肺炎支原体感染的小鼠中可以逆转肺炎支原体诱导小鼠体内的NLRP3炎症体和NF-κB途径的激活、Caspase-3表达、促纤维化相关蛋白TGF-SMA、胶原I和胶原Ⅲ的上调，抑制细胞焦亡从而改善肺纤维化，并抑制肺部炎症，表明虎杖苷可以抑制肺纤维化的发生发展，作为肺纤维化潜在的治疗药物。一些植物中提取到的成分也被证明可以通过抑制细胞焦亡从而改善肺纤维化。实验证明从石蒜科植物中提取的生物碱LYC可以靶向ASC和阻断ASC与NLRP3的相互作用，减轻博来霉素诱导的肺纤维化的炎性小体激活和细胞焦亡，并且发现LYC能显著降低Caspase-1的释放和IL-1β的成熟形式[45]，以上研究表明LYC可能通过抑制细胞焦亡中NLRP3炎性小体活化而成为治疗肺纤维化的潜在药物。虽然LYC已经在国外被作为治疗肺部急性炎症的药物，但是其在肺纤维化中的治疗作用，仍需大量的研究验证及临床效果证明。Withaferin A(WA)是从睡莲属植物中分离得到的一种C5，C6-环氧甾体内酯。对照实验表明WA治疗的卵清蛋白诱导的肺纤维化小鼠体内I型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、TIMP-1和波形蛋白的mRNA表达及TGF-β1、成纤维细胞活化与成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP1)，纤连蛋白和波形蛋白等均减低，并且细胞焦亡相关的NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA水平也显著降低，提示WA在肺纤维化及肺部炎症的治疗中有效[46]。流行病学调查显示，含有聚六亚甲基胍磷酸(PHMG-P)的加湿器消毒剂导致肺损伤和呼吸衰竭，其特征是细支气管闭塞和随后的大量肺纤维化[47]。Kim等[48]实验证明小豆中分离得到的齐墩果酸乙酸酯(OAA)通过降低PHMG-P处理的小鼠肺中NLRP3、ASC和Caspase-1的水平抑制肺纤维化进展。此外，一些研究发现干细胞也可通过抑制细胞焦亡抑制肺纤维化。Zhao等人[49]发现人类骨髓间充质干细胞通过其免疫抑制和抗纤维化功能保护肺免受肺纤维化的影响。月经血源性子宫内膜干细胞(MenSCs)的外体let-7可靶向LOX1调节NLRP3信号，从而抑制ROS激活和线粒体DNA损伤，MANSC分泌的外切体可能通过影响ROS的产生和mtDNA损伤而对肺纤维化和肺泡上皮细胞损伤起到保护作用[50]。此外，积雪草酸(Asiatic acid，AA)亦可以通过抑制炎性小体NLRP3的激活抑制细胞焦亡的发生，减轻肺纤维化[51]。细胞焦亡在肺纤维化中起重要作用，通过阻断炎性小体的激活、Caspase-1、IL-1β和IL-18等因子的释放，抑制细胞焦亡可能是改善肺纤维化患者预后的重要途径，为肺纤维化的治疗展开了新的方向。但是目前对于炎性小体的NLRP3的研究较为多见，其他炎性小体NLRP1、NLRC4、AIM2等在肺纤维化中的作用机制仍不明确，抑制NLRP3的同时是否抑制了细胞焦亡其他因子，及对其抑制作用程度是否相同，仍需通过相应的功能实验及对照实验证明。

小结

肺纤维化的发生发展是一个多因素共同作用的病理生理过程。细胞焦亡的激活可介导炎症参与肺纤维化的发生发展的过程，而抑制Caspase-1、IL-1β和IL-18等细胞因子释放，调控细胞焦亡通路的活化，继而可以减轻肺组织炎症，缓解肺纤维化的进展。但是仍有以下问题需要进一步的思考：(1)细胞焦亡与巨噬细胞尤其是M2型巨噬细胞的极化相应的信号通路及影响因素，可以通过构建细胞焦亡的纤维化模型进一步验证巨噬细胞极化与细胞焦亡共同作用的因子；(2)炎性小体在肺泡上皮EMT的具体机制及诱发因素，可以在多种不同环境下构建肺纤维化动物模型进一步验证EMT发生的不同速度；(3)是否细胞焦亡相关的其他因子也可以抑制肺泡上皮EMT，可以构建细胞焦亡的肺纤维化动物模型探讨除了NLRP3外的其他细胞焦亡相关因子对肺细胞的作用；(4)抑制细胞焦亡的相关药物是否可以作为肺纤维化的临床用药，可以通过构建药物的动物模型探讨其可能产生的毒副作用。因此鉴于细胞焦亡在肺纤维化的发病机理中具有广泛而有效的作用，进一步研究细胞焦亡的确切机制为治疗和诊断肺纤维化提供新的可能性和新的治疗靶点是非常必要的。