角膜新生血管抗血管内皮生长因子治疗新途径△

龚雨婷 王林农

[南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)眼科 南京 210006]

角膜是透明的，无血管及淋巴。其无血管状态是以低水平的促血管生成因子和高水平的抗血管生成因子为基础，这些因子维持角膜透明，使其成为重要屈光介质。各种生理、病理情况，如角膜感染、严重碱烧伤、角膜缘干细胞缺乏症、眼外伤、过敏等[1]，若促血管生成因子和抗血管生成因子间的平衡破坏，并倾向于促血管生成因子一方，角膜无血管状态改变，角膜缘血管网形成新生血管，即角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)[2]。CNV侵袭角膜导致基质混浊及角膜表面不规则，伴液体、脂质外渗，出现角膜水肿及基质结构改变[1]，降低角膜清晰度，从而导致视力下降。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是高度保守的同源二聚体糖蛋白，在眼部广泛分布，主要集中在视网膜神经节细胞层、内核层、视网膜色素上皮层[3]，在角膜上皮中也有表达[4]，其促血管生成步骤包括免疫细胞募集、蛋白水解活性、内皮细胞增殖、迁移以及毛细血管形成[5]。视网膜新生血管的形成与缺血、缺氧密切相关，缺氧是导致VEGF升高的最主要因素[6]。因此，玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗视网膜新生血管效果较好[7]。而CNV的形成除缺血、缺氧外，还与炎症、角膜修复、角膜损伤、感染等相关，VEGF、表皮生长因子、转化生长因子-β、白细胞介素、血管生成素、细胞间黏附因子-1、环氧化酶-2和基质金属蛋白酶家族等多种因子均表达升高[1]，局部滴眼、结膜下注射、基质内注射常规途径抗VEGF治疗CNV 的效果不如治疗视网膜新生血管效果显著，常需要综合治疗。VEGF是CNV形成过程中重要的调控因子[5]，VEGF mRNA及蛋白表达水平与CNV形成呈正相关，拮抗VEGF可抑制CNV形成[8]。本文就抗VEGF治疗CNV的新途径综述如下。

1 抗VEGF药物治疗CNV常规途径及其不良反应

目前，抗VEGF药物治疗CNV的常规给药途径是局部滴眼、结膜下注射、基质内注射，其中，最常用的是局部滴眼。Aksoy等[9]报道了1例7岁男孩持续性角膜中央上皮缺损、基质混浊和CNV，局部使用透明质酸钠及卡波姆凝胶2周后未见明显好转，而局部滴用2 mg·0.05 mL-1阿柏西普治疗7 d则观察到CNV完全消退。舒尼替尼是一种新型小分子、多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，具有抗肿瘤、抗新生血管等功能[10]。Harun等[11]将硝酸银施于兔角膜形成CNV，每天2次给予0.5 μg·mL-1舒尼替尼滴眼液，持续2 周，与对照组(同等浓度生理盐水点眼)相比， CNV中VEGF-A和VEGFR-2的水平明显降低。

由于药物高分子量限制角膜上皮渗透，局部滴眼疗效可能受到限制[12]，结膜下及角膜基质内注射抗VEGF药物提高药物利用率，减少药物用量，且疗效更佳[13]。一位有酒糟鼻病史的63岁女性，因视力下降就诊，检查发现CNV，既往用地塞米松和妥布霉素治疗，病情恶化。2次结膜下注射1.5 mg贝伐单抗(avastin，AVA)，间隔2个月，发现CNV消除，并且随诊4年未复发[14]。然而，结膜下用药导致药物更快进入体循环，增加血管痉挛等心血管意外发生风险，同时，药物在角膜内作用时间有限，对成熟CNV作用有限[15]。

研究发现，与结膜下注射相比，角膜基质内注射抗VEGF药物，药物直接进入角膜基质，接触深层血管，因此治疗深层血管疗效更佳[16]，这可能是由于作用时间较长且正常角膜缘脉管系统清除速度较慢[17]。一项研究[18]由14例经评估需要进行角膜移植的角膜深层CNV患者参加，他们每4～8周接受基质内注射0.05～0.1 mL贝伐单抗(2.5 mg·0.1 mL-1)，而角膜移植术前则需进行1～3次基质内注射，长达3年的随访结果：14.2%的患者新生血管完全消退，无需进行角膜移植，21.4%的患者观察到持续CNV形成，57%的患者成功进行了穿透性角膜移植术。其中，2 例患者出现角膜上皮缺损，自行愈合，1例患者出现自限性基质内出血，5周后自行消退。因此，基质内注射贝伐单抗可以安全、有效地治疗慢性深层CNV，促进角膜移植成功。

在动物模型和临床实践中发现，长期、高浓度使用贝伐单抗会导致局部及全身不良反应，局部如伤口愈合延迟和上皮病变[19]，抑制角膜神经再生[5]，甚至角膜溶解、停药后反应[19]，严重者则引起高血压等全身疾病[5]。一项研究[20]表明，高浓度(25 mg·mL-1)贝伐单抗局部滴用治疗CNV，每日4次，持续2 周后出现轻度、短暂的不良反应。1例有眼睑肿胀，停用后消失，1例有轻度浅表点状角膜炎，人工泪液治疗后好转，1例有睑板腺囊肿，局部治疗2周后症状明显好转。更早些的研究[21]表明，10例接受12.5 mg·mL-1贝伐珠单抗治疗的患者有6例出现上皮病，27例接受5 mg·mL-1贝伐珠单抗治疗的患者有5例出现上皮病，接受1～5 mg·mL-1贝伐珠单抗的患者没有出现上述不良反应。这些不良反应可能是因为贝伐单抗诱导整联蛋白α和β下调，干扰细胞迁移的黏附机制，影响角膜上皮愈合[22]。但尚没有研究或指南明确提出抗VEGF药物治疗CNV时发生不良反应的标准处理方法。

2 抗VEGF治疗CNV新途径

以上是抗VEGF药物治疗CNV的常规途径，存在角膜渗透率低、药物清除率高、作用持续时间短等问题，导致疗效欠佳。近年来，随着科技进步，各种新型途径涌现，为提高抗VEGF治疗CNV的疗效带来新思路。

2.1 水凝胶(hydrogels) 水凝胶是一种三维网络结构高分子聚合物，具有极强亲水性、靶向性、生物利用度和安全性，可根据温度、pH值等外界环境改变凝胶结构从而控制药物释放，目前已在软性角膜接触镜等眼科领域应用广泛。目前，水凝胶主要分为温度敏感型水凝胶、pH敏感型水凝胶、离子敏感型水凝胶、光敏水凝胶、超分子水凝胶等[23]。将贝伐单抗与PECA(聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇-聚乙二醇共聚物)水溶液在4 °C下物理混合形成AVA-PECA溶液，在37 °C此溶液发生溶胶-凝胶转变，形成AVA-PECA温度敏感型水凝胶。结果表明，结膜下注射该水凝胶后，有长达28 d的缓释作用，并且与对照组相比，水凝胶组角膜中药物浓度更高且抗CNV作用更强，也无眼压升高、角膜内皮细胞形态异常等不良反应[24]。尼达尼布是一种新型VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂，既往研究表明，尼达尼布滴眼液可以抑制小鼠模型中CNV的形成，但是其长期疗效欠佳。将尼布尼达粉末加入水凝胶基质中形成尼达尼布热敏水凝胶(nintedanib thermosensitive hydrogel，NTH)，在大鼠烧伤模型中使用NTH，结果表明，NTH在体温下呈胶体状，有利于药物缓释，能长期显著抑制碱烧伤大鼠CNV[25]。但是，由于水凝胶仍面临角膜上皮渗透性差、角膜清除率高、药物利用率有待提高等问题，因此，部分学者提出将水凝胶技术与纳米技术结合，增强药物渗透及释放。

2.2 纳米技术 纳米材料，直径1～100 nm，具有易制备、易降解、靶向性强、刺激性小等特点，近年来在CNV治疗方面体现出优越性。7 d内每天1次在CNV大鼠模型中滴用贝伐单抗负载的白蛋白纳米颗粒滴眼液，提示用纳米颗粒负载的贝伐单抗治疗的CNV面积较游离贝伐单抗小约2倍，且前者显示出较低水平的纤维化、炎症和水肿[26]。有研究[27]表明，将贝伐单抗负载的介孔二氧化硅纳米粒子掺入含环孢素A 的热凝胶基质中，开发了一种新型纳米杂化物，可持续调节贝伐单抗和环孢素A的体外释放长达4周，协同抗VEGF和抗炎作用增强CNV抑制。结果表明，在兔模型中，该纳米杂化物组明显缩小CNV面积、血管长度及不透明区域，同时具有强大的体内及体外抑制作用。为了使用方便、侵入性更小、更安全给药，可将纳米技术与隐形眼镜相结合，增加药物在角膜表明停留时间[28]。然而，纳米颗粒对角膜上皮有毒性作用，如何减小其毒性仍是目前纳米技术面临的重大挑战。

2.3 Mi-RNA及Si-RNA 微小RNA(micro-RNA，Mi-RNA)和小干扰 RNA(small interfering RNAs, Si-RNAs)均约20核苷酸大小，但前者是单链RNA，可降解靶基因mRNA 或抑制靶基因翻译调控基因表达，后者则是双链RNA，只能通过降解靶基因mRNA起调控作用[29]。眼部mi-RNA可通过转录后水平调控促血管生成与抗血管生成之间的动态平衡来调节CNV形成[30]，在治疗CNV方面取得一定疗效[31]。miR-132、miR-155、miR-206 、miR-21 、miR-184 均与CNV形成相关[32]。有研究[33]发现，碱烧伤形成CNV后，miR-21、VEGF-A 和缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)明显增高，miR-21抑制剂能抑制HIF-1α聚集，降低VEGF-A表达，抑制CNV面积及数量。最新研究[34]表明，miR-497是CNV发病机制中的关键介质，可作为CNV治疗新靶点。结膜下注射si-RNA到小鼠眼部，可沉默VEGF-A、VEGFR-1和VEGFR-2，抑制约60% CNV形成[35]。局部结膜下递送10 μg·10 μL-1靶向 VEGF 通路基因的 siRNA 双链体可有效抑制CNV 生成[36]。

2.4 微孔给药系统 将载有2 mg贝伐单抗的微孔给药系统(1.5 mm×1.5 mm×4 mm)植入3只角膜碱损伤后兔模型的下方球结膜下，3个月随访结果提示，该微孔给药系统可明显抑制角膜上方CNV、基质瘢痕、内皮细胞损失和炎症，但是对角膜下方CNV抑制作用有限。作者推测与炎症因子重力聚集有关，提出加用抗胎盘生长因子药物联合治疗，可以同时抑制角膜上方及下方CNV，并且改善了角膜碱烧伤后的角膜上皮化。同时，在视网膜中也实现了持续的抗VEGF递送，提示同时具有抗视网膜新生血管作用[37]。但是，由于微孔给药系统体积较大，且属于植入物，不能生物降解，因此，易聚集淋巴细胞及巨噬细胞，引起炎症反应，可以联合使用类固醇类药物预防及治疗，故生物降解性微孔给药系统仍是目前研发关键及难点[37]。

2.5 联合疗法 1例49岁男性患者，有双侧准分子激光原位角膜磨镶术和左眼水痘带状疱疹角膜炎病史，自诉左眼视力下降，查体发现左眼严重CNV，既往全身使用伐昔洛韦及外用激素治疗效果欠佳。单次使用氩绿激光光凝联合结膜下注射贝伐单抗来治疗恶化的CNV，6周的随访结果提示患者左眼CNV显著消退，视力较前改善。但由于患者依从性差，未继续治疗及随访。4个月后再次随访，CNV面积较激光干预前仍减小，提示氩绿激光光凝和结膜下注射贝伐单抗的联合治疗可长期有效抑制CNV，但仍需更多的研究来确定治疗的最佳间隔、抗 VEGF药物的剂量和激光的量[38]。此研究提示，对于部分难治性CNV,我们可以考虑联合疗法，增强抑制效果。

3 结语

目前抗VEGF药物作用途径众多，且各有利弊。常规的局部滴眼，虽然无创，但由于角膜渗透性差，药物作用时间短、浓度低，因此效果差，并且需要多次用药，患者依从性有限。结膜下注射能有效抑制未成熟CNV，但对成熟CNV作用效果有限，且由于结膜下注射药物直接进入血管，容易引起血管痉挛等不良反应。基质内注射药物能作用于深层血管，但创伤大，且需要多次操作，增加基质内出血等不良反应。

而新型作用途径，如纳米技术脂溶性强，角膜渗透性好，且分子量小，药物毒性小，能有效解决药物浓度低等问题。微孔给药系统等可以持续释放有效浓度的抗VEGF药物，长期抑制CNV，且操作次数少，减少眼内炎等感染风险，但角膜毒性等副作用仍需进一步研究。水凝胶则能根据温度、pH等外界环境变换形态，使药物均匀涂布，能够利用凝胶黏性，长时间停留在眼表发挥作用。mi-RNA及si-RNA则从基因层面直接抑制CNV形成，效果显著。但上述途径操作难度大，技术要求高，仍有药物毒性、难以生物降解等问题，且目前仍局限于动物实验，需要大量临床研究结果支持。

综上所述，CNV是目前角膜盲的重要病因，也是角膜移植排斥甚至角膜移植失败的重要原因。抗VEGF治疗仍是目前CNV重要治疗方法，随着科技的进步，涌现出各式各样的作用途径，相对于不同的CNV则有不同的治疗途径，有时则需联合多种途径治疗CNV，提高其疗效。目前针对不同途径的利弊仍需进一步临床研究，开发出更安全、有效、方便的途径。