中药逆转白血病多药耐药机制研究进展

★ 马嘉鑫 刘永忠 李文宏 雷婷 段丽婷 廖玉群（.江西中医药大学 南昌 330004；. 江西药都仁和制药有限公司 江西 樟树 3300）

白血病是造血干细胞恶性克隆性疾病，异质性高，预后差。在中医学中，白血病属于“虚劳”“髓痨”“血积”“症瘕”等范畴［1］。一般来说，白血病的治疗以综合性治疗为主，采用化学疗法、放射疗法、靶向治疗、免疫治疗及骨髓干细胞移植等方法，以化疗为主要手段，但化疗的毒副作用较大，且随之产生的多药耐药（multidrug resistance，MDR）也是白血病患者进行有效治疗的主要障碍。白血病多药耐药是指在治疗过程中白血病细胞接触一种药物后，对该种药物出现耐药性的同时，对多种结构不同和作用机制各异的其他药物也产生了交叉耐受［2-3］。MDR有两种表型：一种是首次使用化疗药物就产生耐药，称为原发性耐药；另一种则是在化疗过程中产生耐药，称为继发性耐药［4-5］。目前寻求安全、有效的耐药逆转剂，探索治疗过程中产生MDR的机理，提高白血病对化疗的敏感性，是科研工作者和临床医生共同奋斗的目标。而中药具有多靶点，多阶段，毒副作用小，安全有效的优点。因此，探讨中药及其有效成分逆转白血病多药耐药及其机制研究具有重要意义。国内外研究表明，多药耐药产生的分子机制异常复杂，是蛋白表达、酶类介导、靶点改变、基因突变等多重因素共同参与的结果［3,5-7］。目前发现的引起白血病多药耐药机制主要有：多药耐药基因（multidrug resistance gene，MDR1）及其编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白（MDR-associated protein，MRP）等表达介导的药物外排机制［7-8］；Bcl-2等细胞凋亡相关基因的过表达，拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）数量及活性的异常；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽巯基转移酶（GSTs）作用，核转录因子NF-κB等信号的激活等。

1 中药逆转药物外排机制介导的MDR

1.1 P-gp蛋白

P-gp是由MDR1编码的ABC转运蛋白超家族成员，由P-gp介导的药物外排是产生白血病MDR的主要机制之一［6,9］。P-gp具有药物外输泵功能，P-gp的过表达使药物外排能力增强，细胞内化疗药物浓度下降，从而导致MDR的发生［10-11］。多种中药单体、中药复方等通过下调P-gp表达从而逆转白血病多药耐药的发生。研究发现蝎毒多肽可下调经阿霉素（adriamycin，ADR）作用的经典髓系白血病K562/A02多药耐药细胞株P-gp表达水平［12］，从而逆转白血病干细胞多药耐药。Jing Shen等［13］研究表明，槲皮素联合热疗预处理对白血病多药耐药K562/A细胞具有显著的MDR逆转活性，其活性可能与抑制P-gp和HSP70的过表达，增加ADR在细胞内的积聚有关。甲基莲心碱能增强K562/A02细胞对STI571的敏感性，下调其MDR1mRNA的转录和阻断P-gp的表达，从而逆转白血病的多药耐药性［14］。扶正祛邪中药复方含药血清联合干扰素可降低长春新碱诱导的急性早幼粒白血病耐药细胞株HL60/VCR耐药基因P-gp表达水平，从而实现逆转多药耐药［15］。

1.2 MRP蛋白

MRP与P-gp同为ATP结合的盒式膜转运蛋白的家族成员［6］，MRP的高表达通过介导细胞内的化疗药物排出，改变药物在细胞内分布，从而引发白血病MDR的发生。MRP特异性转运底物是胞内与还原型谷胱甘肽（GSH）共轭结合的化疗药物，如依托泊苷、米托蒽醌等。多种中药单体、中药复方等通过下调MRP表达从而逆转白血病多药耐药的发生［16-17］。如芍药苷［18］和山奈酚［19］可抑制K562/ADR细胞株MRP1表达，从而增加K562/ADR细胞内ADR的浓度，实现K562/ADR细胞对ADR耐药性的逆转。

1.3 P-170蛋白

P-170是多药耐药基因MDR1编码的跨膜蛋白，具有ATP酶活性及转运功能，P-170的过表达使药物外排能力增强，细胞内化疗药物浓度下降，从而导致MDR的发生［20］。研究表明中药单体成分苦参碱、姜黄素、川芎嗪作用于白血病多药耐药细胞株K562/ADR后，可不同程度的抑制P-170蛋白的表达，与耐药逆转作用成正相关［21］。三七总皂甙能够部分逆转白血病耐药细胞K562/VCR的耐药性，其主要机制为直接或间接抑制多药耐药基因表达P-170糖蛋白，减少其药物外排作用，从而逆转多药耐药［22］。麻黄碱通过下调K562/A02细胞膜糖蛋白P-170的表达，抑制其将化疗药物“泵”出细胞外的功能，提高化疗药物在K562/A02细胞内的有效质量浓度，能部分逆转K562/A02细胞的多药耐药性［23］。

2 中药逆转细胞凋亡相关基因异常表达介导的MDR

当白血病细胞内由于遗传因素或化疗药物等外源因素的诱导，引起凋亡通路中的抗凋亡蛋白过量表达、促凋亡因子低表达或失活以及存活信号通路活性增强。凋亡通路中的这些异常改变单独或共同作用，使得白血病细胞凋亡受阻，对多种化疗药物诱导的凋亡不敏感，表现为MDR［24］。

2.1 Bax/Bcl-2失衡

MDR产生的机制也与Bcl-2家庭成员表达异常有关（促凋亡基因Bax下调和抗凋亡基因上调）［7］。Bcl-2过表达引起的耐药为非泵耐药，且Bcl-2的过度表达会刺激MDR1表达［25］。Bcl-2是对抗凋亡刺激的关键抑制剂，能抑制化疗药物导致的细胞凋亡，从而诱导细胞产生耐药。聚乙二醇化脂质体，单独使用或与反义寡核苷酸联合使用，激活Bax并抑制Bcl-2，显著抑制了非泵耐药［26］。故多种中药单体、复方等通过调控Bcl-2的表达抑制白血病细胞多药耐药的发生。

研究发现蟾酥能够逆转CEM/VCR细胞的多药耐药性，其机制可能是通过下调Bcl-2和上调Bax的表达，促进CEM/VCR细胞凋亡；下调P-gp的表达，增强CEM/VCR细胞对VCR的敏感性有关［27］。Misra R等［28］将姜黄根茎中提取的黄色素姜黄素联合ADR做成小微米粒，作用于K562细胞，研究发现姜黄素延长了姜黄素在胞核中存在的时间，且通过抑制Bcl-2分子的表达，增加对K562细胞的毒性，逆转耐药，协同促进该细胞凋亡。出自《太平惠民和剂局方》的中药复方君子汤联合ADR作用于白血病K562/VCR耐药细胞株，Bax蛋白表达显著上调，Bcl-2蛋白表达显著下调，无细胞毒性的君子汤和ADR对K562/VCR细胞耐药性均有逆转作用，两药联合应用具有明显的协同效应，其机制可能与其上调促凋亡基因Bax和下调抗凋亡基因Bcl-2的表达有关［29］。

2.2 p53的缺失与突变

p53是一种肿瘤抑制基因，通过Bax/Bcl-2，Fas/Apol，IGF-BP3等蛋白，p53可完成对细胞凋亡的调控作用。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C的释放，具有凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。而如果p53基因发生了突变，对细胞的增殖失去控制，则会导致细胞癌变［30］。p53基因突变的肿瘤细胞，会诱导激活MDR1启动子，从而产生耐药性［25］。三氧化二砷与白藜芦醇联合可显著降低K562-GFP/ADM细胞耐药基因MDR1/P-gp以及凋亡抑制基因Bcl-2、NF-κB和p53基因的表达，增强Bax表达和Caspase-3的活化，从而逆转多药耐药［31］。Wang D H 等［32］研究表明，砒霜提取物三氧化二砷（As2O3）作用于白血病K562/ADR耐药细胞后，p53蛋白水平升高，P-gp水平下降，RT-PCR检测到Fas和Caspase-3基因mRNA产物增加，MDR1 mRNA减少，As2O3处理后Caspase-3活性也明显增强，As2O3能够诱导白血病K562/ADR多药耐药细胞凋亡，逆转耐药。

2.3 NF-κB异常激活

核转录因子NF-κB属于肿瘤细胞异常表达的转录因子，NF-κB的错误调节与自身免疫病、慢性炎症以及很多癌症的发生密切相关［3］。研究提示，NF-κB的异常表达与白血病有一定的相关性，且认为NF-κB的激活是促白血病细胞存活的重要因素［33］。NF-κB一般存在于细胞质中，细胞受刺激后，与很多基因的相应位点发生特异性结合，增强转录，使自身免于凋亡。多研究表明，NF-κB的活性升高与白血病细胞的多药耐药产生密切相关。且多种中药单体及复方通过阻断NF-κB信号通路等方式逆转多药耐药。马武开等［34］研究表明，解毒化瘀药对HL60/ADR细胞的耐药逆转作用可能是通过阻断NF-κB信号通路，影响MDR1耐药基因的表达，进一步逆转耐药。研究表明非细胞毒剂量雷公藤红素作用于人白血病多药耐药细胞株K562/A02后，K562/A02细胞核转录因子NF-κB及survivin mRNA表达水平均降低，逆转了NFκB-survivin途径介导的K562/A02细胞多药耐药（化疗药物通过激活NF-κB的表达引起凋亡抑制因子survivin的表达，从而抑制白血病细胞的凋亡，产生耐药）［35］。As2O3可通过调节NFκB，进而抑制MDR1基因表达，逆转白血病多药耐药［10］。

3 中药逆转酶量与活性介导的MDR

3.1 DNA拓扑异构酶

TopoⅡ是细胞内的一种重要核酶，参与DNA的重组、修复、转录、复制过程［36］。TopoⅡ是目前抗癌药物重要的作用靶点，当细胞内TopoⅡ含量降低或酶活性减弱位点突变等，抗癌药物的作用靶点减少，从而产生MDR。TopoⅡ介导的耐药与TopoⅡ磷酸化水平提高，TopoⅡ酶水平下降，TopoⅡ基因位点的突变、缺失有关［37］。因此，多种中药单体及复方，通过调控TopoⅡ表达实现逆转多药耐药的发生。高剂量复方浙贝颗粒联合顺铂作用于急性淋巴细胞白血病耐药细胞株L1210/CDDP移植瘤细胞，TopⅡ表达明显升高，GSTs表达明显降低，逆转其多药耐药性，增加白血病细胞对药物的敏感性［38］。黄连解毒汤所含的黄芩苷和京尼平苷作用于白血病耐药细胞株K562/ADR，使TopoⅡ基因表达逐渐降低，Caspase-3基因表达逐渐增强，MDR1基因表达明显抑制，干预与逆转白血病多药耐药［39］。

3.2 谷胱甘肽及其相关酶

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用［40-41］。GSH通过自行或经GSTs催化过氧化氢和过氧化酯质，在细胞解毒、抗损伤等过程中起重要作用［42］，GSTs是细胞抗损伤、抗癌变的重要解毒系统，多药耐药细胞伴有GSTs的高表达。因此，已有多种中药有效成分及复方通过下调GSTs的表达来逆转MDR的发生［43］。白花蛇舌草熊果酸作用于白血病耐药细胞株K562/ADR，随着作用剂量和时间的延长，GSH含量明显减少，GST和GSH-Px的活性逐渐下降，从而诱导K562/ADR凋亡，逆转多药耐药［44］。砒霜提取物As2O3联合非米司酮作用于白血病耐药K562/ADR细胞，逆转倍数明显增高，GSH含量明显降低，对细胞增殖及其诱导凋亡的效果明显增高，耐药逆转作用增强，机制与GSH含量改变有关［45］。此外，川芎嗪衍生物DLJ14和贝母素甲能引起GSH水平下降、下调GSTs相关酶活性来逆转慢性髓系白血病多药耐药［46-47］。

3.3 环氧合酶

目前为止发现两种环氧合酶：COX-1和COX-2。COX-2主要分布在细胞核膜上，被认为是诱导性反应基因，即“快速反应基因”，参与白血病的发生、发展［48］。在肿瘤细胞中，COX-2可以调节MDR1/P-gp的表达［49］。槲皮素是一个COX-2启动子依赖的转录和激活抑制剂，显著下调ADR诱导的白血病HL-60细胞COX-2和MDR1 mRNA共表达，逆转HL-60细胞MDR［50］。桂琳等［51］研究发现，苦参碱、塞来昔布单独或联合应用于白血病耐药细胞K562/A02后，凋亡率增加COX-2 mRNA、MDR1以及P-gp、COX-2蛋白表达明显下降，有逆转细胞K562/A02耐药的作用。

4 结语

在白血病的治疗中，中西医相结合是符合发展趋势的必然结果，对于当前白血病研究的重点热点多药耐药问题，利用中药单体及复方逆转多药耐药已经取得了许多成果，但如何将其更好的结合是需要我们不断思考的问题。目前已有的关于中药逆转白血病多药耐药的研究仍存在很多不足，如更倾向于体外实验，多为研究中药提取物及复方对白血病多药耐药细胞的作用，更无法及时有效的与临床相结合；中药种类较多，提取物丰富，中药复方更是千变万化，使得研究范围过大，无法全覆盖，难以集中目标；相关基础研究较少，无法进行更加深入的研究等问题，仍需要不断的改进，积极将中西医相结合，寻求安全、有效的耐药逆转剂，提高白血病对化疗的敏感性，探索治疗过程中产生MDR的机理。我们应发挥中医中药学及西医学特质，辨证论治、司外揣内与分析还原、微观研究相结合，使中药逆转白血病多药耐药研究向着更贴合临床应用。