宿主转录标志物GBP5、DUSP3和KLF2的研究进展

韩婷婷 陈秋奇 邓国防

结核分枝杆菌引起的结核病是世界范围内一个主要的健康问题，是单一感染源导致死亡的主要原因[1]。及时予以适当的治疗对结核病的控制以及减少其在社区中的传播至关重要，而减少全球结核病负担的关键要求是寻找到更好的诊断方法和监测治疗反应的工具[2]。2021年WHO报告的全球新发的987万例结核病患者中，41%的患者是未经细菌学证实的[3]。这表明现有的诊断方法，存在一定的缺陷和不足[4-5]。因此，可改善结核病临床诊断并用于结核病治疗监测的基因宿主转录标志物鸟苷酸结合蛋白5(guanylate binding protein5,GBP5)、双特异性磷酸酶3(dual specificity phosphatase3，DUSP3)、Krüppel样转录因子2(Krüppel-like transcription factor2,KLF2)，具有一定的临床价值，笔者从这3个基因宿主转录标志物的发现、发展、临床价值和局限性等方面进行综述。

一、 宿主转录标志物在结核病诊断中的价值

活动性结核病(active tuberculosis，ATB)主要是根据患者的症状、体征、病理和细菌学证据进行诊断的[1]。活动性结核病的实验室诊断标准是从标本中检测出结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)。由于标本获取难度较大(如难以从症状已改善的患者中获取合格的痰液标本)以及实验室检查方法在肺外结核中缺乏敏感度，仅约60%的患者能够通过实验室检查确诊[6]。结核病分子生物学诊断方法GeneXpert MTB/RIF虽然在菌阳结核病患者中有着良好的效果，极大地提高了结核病的诊断能力，但其在菌阴结核病患者中敏感度较低，且不能用于监测抗结核治疗过程中的治疗反应[4, 7]。其次，这一方法依赖于痰标本[7]，但痰标本在患者症状改善后较难获得。虽然可以使用支气管肺泡灌洗液作为痰液的替代品，但其在资源有限的国家中较难普及，支气管镜在儿童中也较难实施[1, 7]。因此，寻求一种不依靠痰标本即可监测结核病治疗反应的检测方法是必要的。而γ干扰素释放试验虽然不使用痰标本即可用于结核分枝杆菌感染的诊断，但其无法区分活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染，并且在合并人类免疫缺陷病毒感染时其结果容易受影响。因此，目前存在的方法具有一定的局限性，人们迫切需要一种基于血标本即可准确诊断结核病的新型免疫学诊断方法，从而解决菌阴结核病，活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染的诊断与鉴别诊断问题[4, 7]。基于血液宿主转录标志物的诊断方法正是一种潜在的解决方案。

研究表明，宿主转录标志物可以区分不同的传染病[8]。利用血液标志物转录的方法，人们能够更好地了解宿主对疾病的反应，有助识别用于诊断、治疗监测和预后的潜在生物标志物。且这一检测基于血液而不依赖痰，其标本易于获得，简单便捷，在应用于结核病的诊断和治疗监测方面有很大的优势[1]。在低发病率和高发病率环境中的几项研究均证实全血转录标志物可提供宿主对结核病反应的广泛视角，显示出结核病与健康对照、结核与其他疾病、结核病与结核分枝杆菌潜伏感染的准确区别[5]。Zak等[9]对血液RNA标志物预测结核病疾病风险的前瞻性队列研究结果中也表明，在结核病出现前18个月的任何一个时间点，通过全血基因表达检测，可以预测从潜伏感染到活动性疾病的进展。因此，这些研究都证实了宿主血液转录标志物在结核病诊断和治疗监测中的重要价值，为研究可推广的、廉价的诊断和治疗监测方法提供了新思路。近10年来，已经提出了几种基于宿主反应的生物标志物系统，以区分活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染、健康对照者和其他疾病，并预测结核分枝杆菌潜伏感染到活动性结核病的进展[10]。这些转录标志物的提出与验证，展现了其在结核病诊断与治疗监测方面的巨大潜力，人们可在临床实施中推行基于宿主反应的诊断方法[10]。

二、 宿主转录标志物在结核病治疗疗效评估中的价值

Thompson等[11]研究证实，临床上可应用的宿主血液RNA标志物可预测结核病的治疗结果。结核分枝杆菌感染可诱导某些基因的转录[12]，使机体某些转录标志物发生变化。而在治疗开始2周后，血液检测很容易就发现转录标志物发生的显著变化，这证明了血液转录标志物可以作为治疗成功反应的早期替代生物标志物[13]，且结核病特异性基因表达标志物会随着抗结核方案的变化而发生变化[14]，意味着这些标志物可能用于抗结核治疗的监测和指导治疗方案的制定。O’Garra等[15]观察到活动性结核病患者的转录标志物在治疗2个月后开始减弱，并在治疗12个月后完全消失，这表明血液中的转录标志物与活动性结核病患者的疾病严重程度相关，并可反映疾病部位的变化。一项用于结核病诊断和治疗监测的6个基因血液转录组学标志物(RISK6)的多国评估发现，与健康对照者相比，活动性结核病的基线RISK6标志物评分更高，随着治疗的进行，这一评分逐渐降低，并在治疗结束时降至健康对照者的评分水平。此外，RISK6标志物评分还能高精度区分未治疗、治疗开始的第2个月、治疗结束时和治疗完成后2个月临床治愈的结核病患者[16]。已发表的10个基因标志物也会随着抗结核治疗而发生变化，使其可能用于监测结核病治疗效果和预测复发[17-18]。Heyckendorf等[19]也指出基因标志物指导的治疗管理可能会大大缩短耐多药结核病患者治疗的持续时间。这些研究都表明活动性结核病患者的血液转录标志物可作为监测结核病治疗效果的强大工具，并指导患者的个体化治疗。

三、 GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物的发现

生物标志物组合中标志物数量的增加虽然可能提高诊断的准确性，但几乎所有可用于检测宿主转录反应的商业平台都受其可检测的标志物数量的限制，因此需要整合出一个在多重检测中具有诊断准确性高的生物标志物组合，用作结核病诊断和治疗监测[1]。世界卫生组织发布的目标产品配置(targetproductprofile，TPP)确定新的结核病诊断方法应具备使用非痰样本(如血液)、在人类免疫缺陷病毒合并结核分枝杆菌感染的患者中总体敏感度保持在80%以上、在菌阳儿童结核病患者中的敏感度超过66%以及操作相对简单等理想特征[7]。为满足这些要求，应寻找快速、准确、便利的诊断准确性高且可在商业平台上检测的生物标志物组合，Sweeney等[7]对来自公共数据集的样本进行综合多队列分析，他们发现了可用来诊断活动性结核病的3个基因宿主转录标志物(GBP5、DUSP3和KLF2)，并验证了它们的诊断能力，证明GBP5、DUSP3和KLF2可以区分活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染、健康对照者和其他疾病，且其表达不受HIV感染状况、细菌耐药性或是否进行卡介苗接种的影响。同时，GBP5、DUSP3和KLF2与活动性肺结核的严重程度显著相关，它随疾病严重程度的增加而增加，随治疗进程的推进而减少，在治疗结束时恢复到与健康对照组相同的水平，因此，其不仅可用于监测结核病的治疗反应[7]，还有助于新药物的开发。因为药物的开发一直受到缺乏可靠的反映疾病严重程度和治疗效果的生物标志物的阻碍[20]。随后，Francisco等[21]的研究也确定GBP5和KLF2可用作活动性结核病的诊断工具，双基因宿主转录标志物也可作为监测活动性结核病治疗的替代生物标志物，进一步证实了3个基因宿主转录标志物在临床应用中的可行性。

四、GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物的发展

最初，Sweeney等[7]提出这3个生物标志物，并使用RT-qPCR算法计算，将3个基因TB评分(简称“TB评分”)定义为: 3-gene TB score=(GBP5+DUSP3)/2-KLF2，Warsinske等[22]利用嵌套式病例对照研究分析了3个队列中的TB评分，假设在 4% 的患病率下，TB 评分诊断活动性结核病患者的敏感度为90%、特异度为70%、阴性预测值为99.3%。在参与研究的队列中，TB评分均能准确诊断出活动性结核病患者，且该评分与患者痰检结果转阳的前6个月从结核分枝杆菌潜伏感染发展为活动性结核病的进展显著相关。TB评分还与活动性结核病患者肺部炎症的严重程度相关。在确诊时，TB评分高于中位数的患者发生持续性肺部炎症的可能性是低于中位数患者的3倍，并且在治疗结束时，发生持续性肺炎患者的TB评分也较高。这些结果表明，TB评分在监测结核分枝杆菌潜伏感染个体、结核病的进展、活动性结核病的诊断、患者肺部的病理变化以及评估治疗反应方面有很大的潜力[22]。Zimmer等[23]的前瞻性评估中TB评分于治疗的第1个月内快速增加[TB评分的中位数增加倍数：1.08(IQR：0.54～1.52)]，并在治疗4个月后趋于平稳[TB评分中位数：1.97(IQR：1.03～2.33)]。在治疗的第1个月，TB评分快速和大幅增加，有望早期识别对结核病治疗有反应的患者。4个月时TB评分变为平台期可能表明疾病的早期清除，可用于指导缩短治疗疗程。肺结核的标准方案治疗包括2个月的异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RPM)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)和吡嗪酰胺(pyrazinamid，PZA)联合应用的强化期和4个月异烟肼、利福平的巩固期。肺外和播散性肺结核有时则需要更长时间的治疗：(1)淋巴结结核6个月；(2)关节或骨性结核9个月；(3)中枢神经系统结核12个月[24]。结核病的治疗最少需要6个月的时间，长时间的治疗会降低患者的依从性，而治疗依从性是结核病治疗成功的一个重要组成部分[25]。TB评分的平台期则有望指导缩短治疗的疗程，从而增加结核病患者的依从性，提高治愈率。为了将这3个基因标志物规模化，Cepheid(Sunnyvale, CA, USA)开发了一种基于试剂盒的原型测试(“Xpert MTB Host Response”或Xpert-MTB-HR-Prototype)，将其整合到一个测试平台中，利用GeneXpert检测全血中标志物的表达水平[23]，量化患者全血样本中3个基因标志物的相对 mRNA 水平，直接分析指尖血[26]，满足了Sweeney等[7]对这3个基因宿主转录标志物可在低功耗设备和利用少量的PCR靶点即可运行的预期。Södersten等[26]的研究也确定了3个基因宿主转录标志物在该原型测试系统中实施的可行性，证实了该试剂盒系统中标志物的性能，并再次表明其在分诊测试中能够满足世界卫生组织最低的目标产品配置。该试剂盒也特别适用于某些难以提供痰标本的患者，如人类免疫缺陷病毒感染者(PLHIV)，其在人类免疫缺陷病毒感染合并活动性结核病的患者中，敏感度为 90%。

五、GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物的临床应用价值和不足

Warsinske等[10]对已提出的16个用于诊断活动性结核病的基因标志物进行系统比较，他们发现，一个生物标志物组合中标志物数量的增加并不能提高组合的准确性。在众多标志物组合中，只有GBP5、DUSP3和KLF2基因标志物组合的标志物少于10个，符合世界卫生组织的目标产品配置，且已证明其可在痰培养转化为阳性的前6个月预测活动性结核病的进展、可在主动筛查中区分活动性结核病、跟踪治疗反应，以及对诊断时患有活动性结核病且治疗后出现亚临床活动性结核病可能性较高的患者进行分层。Turner等[27]人在系统评价确定的 27 个符合条件的标志物中，GBP5、DUSP3和KLF2基因标志物组合获得了最高的诊断准确度，与年龄、性别、HIV 状态、既往结核病史或痰涂片结果无关[27]。Hoang等[5]的研究也证实，GBP5、DUSP3和KLF2基因标志物组合在检测活动性肺结核、培养阳性肺结核、高度可能肺结核和肺外结核方面表现最好。这些研究都表明了3基因标志物在结核病诊断和治疗监测方面的重要价值。

GBP5、DUSP3和KLF2基因标志物组合符合WHO分诊测试的最低目标产品概况(敏感度90%，特异度70%)，但其没有符合结核病分诊测试的最佳标准(敏感度95%，特异度80%)，或符合确诊性试验的最低标准(敏感度65%，特异度98%)。在符合条件的标志物中，GBP5、DUSP3和KLF2基因标志物组合虽然具有最高诊断准确性，但其缺乏特异性，无法用于确诊结核病[27]。Hoang等[5]对临床实践中诊断结核病的转录标志物的一项前瞻性、多中心队列研究中，发现所有已发表的转录标志物(包括GBP5、DUSP3和KLF2)在临床实践中均缺乏诊断准确性、敏感度和特异度。在常规的实践环境中，当结核病必须与其他临床表现相似的疾病区分开时，转录标志物不能表现出足够的诊断准确性，不可用于临床。这与Turner等[27]的研究结果是一致的。GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物的诊断特异性不足以提供足够可靠的阳性结果来启动结核病治疗。这些发现，表明了GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物在临床上的应用还面临着许多挑战，它并不是在所有的条件下均有较高的性能。

六、 问题与展望

目前可用于诊断结核病的宿主转录标志物是多样的，而现有的研究表明，GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物组合在所有已提出的标志物中表现得最好[5,10]，虽然其在临床常规实践中无法用于确诊结核病，但其在检测结核分枝杆菌潜伏感染的个体、结核病的进展以及评估治疗反应的潜力是不可否认的，且其已经开发出可以使用的试剂盒(Xpert-MTB-HR-Prototype)将其整合到测试平台中检测其在全血中的表达水平，使其在临床中应用成为可能。未来，我们对其研究可致力于将TB评分与其他的诊断方法结合起来，从而增加其诊断的性能。且现有的研究已证实GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物组合可在痰培养转化为阳性的前6个月预测活动性结核病的进展，表明其有望成为一种筛查的手段，在人群中筛查出可能进展为活动性结核病的结核分枝杆菌潜伏感染者，从而指导提前进行干预，阻断结核病发展进程。但这一设想，必定受Xpert-MTB-HR-Prototype的价格、稳定性、对检测人员的要求等限制。因此，控制成本及其操作难度，是GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物组合广泛应用面临的难题。虽然GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主转录标志物组合的研究结果令人鼓舞，但其在临床应用的实际性能、其测试平台的开发、以及在实践过程中的实用性仍需不断的进行探索。

利益冲突声明所有作者均声明无利益冲突

作者贡献韩婷婷：查阅文献，撰写论文；陈秋奇：审阅修改；邓国防：审阅修改，指导撰写