重视结核分枝杆菌抗原检测技术研发

孙照刚

结核病疫情防控面临的新形势需要考虑新的快速、便捷的早期筛查或诊断技术。该技术既要脱离分枝杆菌培养，又要避免核酸检测所需要的较为复杂的核酸提取和扩增技术，还要注重生物安全性。因此，简便、快速和廉价的免疫学诊断技术是结核病研究人员重点关注并且坚持不懈的努力方向。

由于机体被结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染后，体内首先出现的是MTB特异性抗原。MTB抗原的检测不受宿主免疫功能状态的影响，可以作为MTB感染的直接证据。尽管世界卫生组织(World Health Organization，WHO)在2011年基于更早的10年间的数据指出：目前市面上商业性血液(血清学)检测手段诊断活动性结核病，常导致误诊和不当治疗[1]。如今，随着MTB抗原检测新技术在敏感度和特异度等方面的提高，使得结核病快速确诊技术更为可靠。并且，对于菌阴肺结核、难以诊断的肺外结核，以及对免疫功能低下患者等特定群体而言，MTB抗原检测具有更重要的积极意义，应成为优先考虑的技术研究方向。笔者就MTB抗原检测的现有进展及未来发展方向进行阐述。

一、目前检测的MTB抗原靶标

(一)单一抗原检测

与抗体检测相对应，抗原检测是直接检测患者标本中MTB抗原成分，单一抗原检测的靶标主要是相对分子质量为14 000、31 000和38 000的蛋白，以及MPT64蛋白、热休克蛋白65(Hsp65)、Ag85蛋白复合物和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)等单一组分。这些单一抗原组分的检测结果表现出明显的特异度和敏感度的差异，仅有个别研究显示的其检测特异度和敏感度都超过了80%。

Silva等[2]采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结核病患者对相对分子质量为14 000蛋白的体液应答，发现该蛋白的体液应答与非活动性结核病相关，其对非活动性结核病患者的体液反应(平均阳性率：0.18%)低于活动性结核病患者(0.21%)，对结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)有一定的诊断价值。同样采用ELISA方法，对结核性脑膜炎(tuberculous meningitis, TBM)患儿脑脊液和血清样本中的相对分子质量为31 000蛋白抗原的检测结果证明，其敏感度分别为90%和80%，特异度均为96%[3]；对结核病患者血清中相对分子质量为38 000蛋白抗原检测的总敏感度为55.2%，阳性预测值为93.5%[4]。唐宇龙等[5]研究表明，MPT64制备的抗体检测血清标本阳性率不高，但特异度较好，用于检测临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率为41.2%，检测非结核病患者和健康对照组血清标本的假阳性率分别为7.1%和53.1%。一项采用间接ELISA方法对TBM患者脑脊液中的Hsp65蛋白抗原进行的前瞻性评估发现，其诊断敏感度和特异度分别为84%和90%[6]。

Ag85蛋白复合物包括Ag85A、Ag85B和Ag85C，是MTB培养液中最常见的分泌蛋白，能诱导体液和细胞免疫反应[7]。Khan等[8]采用间接免疫PCR(I-PCR)和实时定量PCR(RT-I-PCR)方法检测骨关节结核患者临床标本(组织活检、滑膜液和脓液)中Ag85蛋白复合物表达，发现I-PCR检测骨关节结核确诊患者(8例)和临床疑似患者(51例)的敏感度分别为87.5%和70.5%，特异度均为93.9%(33例非结核病对照者)。值得注意的是，I-PCR/RT-I-PCR检测敏感度明显高于ELISA法和GeneXpert法(30例骨关节结核患者)。因此，该检测方法有望成为一种有潜力的结核病诊断试剂盒。

LAM是一种由多糖和脂类组成的复合物，是MTB细胞壁的重要成分，具有较强的免疫原性[9]。LAM是MTB抗原检测中最常见的靶向抗原，Flores等[10]系统综述了LAM抗原在不同类型结核病中的诊断价值，发现各项研究的质量参差不齐。对肺结核诊断敏感度和特异度的范围分别为2%～100%和33%～100%。对合并HIV感染的肺结核患者尿液LAM检测发现其敏感度高于未合并HIV感染者。对肺外结核诊断敏感度和特异度的范围分别为0～100%和62%～100%。五项针对LAM、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、Ag85 复合物和脑脊液中相对分子质量为65 000蛋白抗原检测TBM的研究合并后显示，产生的最高敏感度为87%，但特异度低(84%)。因此，仍需要进一步研究以确定LAM检测对HIV高流行环境中TBM的诊断价值。此外，有研究发现，尿液LAM抗原对儿童结核病有较好的诊断价值，其检测的敏感度和特异度分别为83%和85%[11]。

由于体液中抗原含量较低，单一抗原检测的方法较适合应用于脑脊液和支气管灌洗液等抗原含量相对高的体液标本[4,6,8]，不提倡用于血清等标本的检测。WHO不提倡活动性结核病的血清抗原检测。一方面，MTB特异性抗原的发现存在一定难度；另一主要原因在于，血清中抗原含量少，使用目前常规信号放大技术增加了检测的不准确性。因此，多种抗原同时检测的方法能够在一定程度上克服敏感度差的问题，同时也有助于提升特异度。

(二)多种抗原同时检测

由于患者状态、菌载量和感染阶段的不同，结核病患者对不同MTB抗原的应答反应具有异质性，单一的抗原检测可能会造成假阳性结果的产生。此外，患者标本抗原含量较低，其用于MTB检测敏感度低。因此，多种特异性MTB抗原联合检测能够在一定程度上克服敏感度差的问题，同时可以有效提高检测的特异度[12]。

目前，已有一些较为成熟的蛋白芯片在临床结核病诊断中得以应用。蛋白芯片主要检测LAM和相对分子质量为16 000、38 000的蛋白等主要抗原，但其检测敏感度较低，检测肺结核和肺外结核患者的阳性率分别为66.4%和35.8%，检测慢性消耗的肺外结核患者的阳性检出率明显低于肺结核患者[13]。Zhou等[14]通过谷胱甘肽S-转移酶蛋白融合技术针对MTB分泌蛋白和跨膜蛋白成功构建了一个含有Rv0934、Rv1411c、Rv1566c、Rv1623c、Rv1980c和Rv2031c等6个具有强免疫反应性的抗原组合。多抗原联合检测试剂盒与市售试剂盒的对比研究显示，联合检测试剂盒对活动性肺结核患者血清检测敏感度明显高于市售试剂盒(66.3%与31.6%)。两种检测方法的特异度相似，分别为89.6%和90.6%。贺仁忠等[15]共筛选了8种MTB蛋白抗原(Rv1860、Rv2031c、Rv1441c、Rv0494、Rv3301c、Rv0351、Rvl821和Rv0280)，设计了一款新型蛋白芯片，发现其组合检测LTBI的特异度和敏感度分别达90.9%和83.1%，显示了较好的诊断效能。Kasempimolporn等[16]从MTB休眠调节单元(DosR)中筛选出Rv2029c、Rv2031c、Rv2032、Rv2627c、Rv3133c、Rv3716c等6种蛋白抗原，制备成检测试纸，用于检测患者血清标本，发现检测LTBI 者的敏感度为75.0%，检测非LTBI者的特异度为88.1%。在不同临床情况下(如LTBI、活动性肺结核、结核病患者密切接触者和其他非结核病患者的血清)，此检测试纸的阳性预测值和阴性预测值分别为77.4%和86.7%。由此说明，这6种具有较强免疫原性的联合抗原提高了LTBI检测的敏感度。

质谱技术的高通量检测具有同时检测多种抗原的优势。Kruh-Garcia等[17]采用多反应监测质谱(MRM-MS)技术鉴定的抗原85B、抗原85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和MPT64等外分泌蛋白联合检测可以用来判断MTB的活跃状态。Ma等[18]利用两种仿生亲和层析(biomimetic affinity chromatography，BiAC)培养基(At-23和A115-94)以选择性的消耗血清中白蛋白和免疫球蛋白，然后分馏后的蛋白进行电喷雾碰撞诱导串联质谱(ESI-CID-MS/MS)分析，分别鉴定出FbpA、FbpB和BfrB等3种抗原，并经蛋白免疫印迹(Western Blot)验证，发现FbpA、FbpB和BfrB在经BiAC分离的结核病患者血清标本中具有较高的丰度，提示这3种抗原也可以作为结核病患者检测潜在的生物标志物，具有较好的应用价值。但是这些研究成果均尚未在临床实践中得到应用。其最主要的原因在于质谱和色谱分析操作技术复杂，对操作人员要求较高，同时，设备较为昂贵，并且检测所需血清标本量较多。因此，寻找新的抗原检测方法或抗原富集思路对于提高实验条件较差的基层医院对各种类型MTB感染的阳性检出率具有重要意义。有研究报道，采用人的蛋白SMAD2或核呼吸因子1(NRF1)作为配体，可以同时吸附多种MTB特异性抗原[19]。这种基于配体吸附的MTB抗原检测技术或许是一种简便、快捷、灵敏的抗原检测技术。

二、MTB抗原检测的实现方法

(一)免疫学方法

免疫学方法具有快捷、方便和标准化程度高等优点，是目前MTB抗原检测的常用方法。免疫学方法主要的技术手段包括ELISA、化学发光、时间分辨荧光免疫分析和侧向层析等。这些相应技术的改进提高了MTB抗原的检出效率。张昆南等[20]应用改进的斑点酶联免疫吸附法分别检测TBM患者脑脊液中培养滤液蛋白10(CFP-10)和ESAT-6，发现CFP-10检测的敏感度为93.1%，特异度为92.5%；ESAT-6检测的敏感度为91.4%，特异度为94.3%。两项检测的敏感度和特异度均高于针对MTB菌体或菌体物质进行检测的同类研究，如抗酸染色、MTB培养、PCR等。这表明应用改进的斑点酶联免疫吸附法检测脑脊液中CFP-10和ESAT-6能提高TBM的诊断效能。Broger等[21]建立了检测下限为pg/ml范围内的LAM和ESAT-6的电化学发光(ECL)免疫分析方法，发现检测尿液标本中LAM和ESAT-6用于结核病诊断的总体敏感度分别为93%和65%，检测血清标本中LAM和ESAT-6用于结核病诊断的总体敏感度分别为55%和46%；在所有检测的总体特异度为97%。而且无论HIV感染状况如何，检测敏感度的进一步提高都可以通过优化检测技术和试剂成分来实现。这表明这种方法检测肺结核患者尿液标本的诊断准确度较高。时间分辨荧光免疫法(TRFIA)是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，具有高敏感度、可定量、线性范围宽、稳定性强、成本低等优势。王雪梅等[22]使用该法测定胸腔积液标本CFP-10水平，取CFP-10表达水平临界值为11.92 ng/ml时，其检测结核性胸腔积液的敏感度和特异度分别为96.23%和94.00%，高于结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测血清标本的敏感度和特异度(分别为82.08%和90.00%)。侧向层析技术中最常见的实现方法是由胶体金标记技术发展起来的胶体金免疫快速诊断技术，主要有快速斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析法，具有操作简便、快速、无需仪器设备，试剂性能稳定及成品易于保存等优点，在近几年得到快速发展。崔光辉等[23]分别用斑点金免疫渗滤试验、PCR和痰涂片法检测肺结核患者血清标本，发现斑点金免疫渗滤试验检测阳性率为82.14%，明显高于痰涂片(37.14%)和PCR(58.57%)。

(二)质谱技术

质谱分析技术在检测的敏感度、特异度、分析速度、多指标同时检测等方面有非常大的优势，在新生儿遗传代谢病筛查、维生素及激素监测、治疗药物监测、微生物鉴定等领域已有应用。它是将样品分子经过离子化后，利用其不同质荷比(m/z)的离子在静电场或磁场中受到的作用力不同而改变运动方向，使其彼此在空间上分离，最后通过收集和检测这些离子得到质谱图谱，实现分析目的的一种分析方法。此外，质谱分析技术受样本处理复杂及成本高等限制，目前尚未大范围推广使用。

Fan等[24]用液相色谱-质谱法定量检测HIV感染者血清中MTB毒力因子CFP-10，发现培养阳性和阴性肺结核患者CFP-10检出率分别为89.6%和66.7%，检测非结核病对照组的特异度为88%。血清CFP-10抗原检测和培养对60例肺结核患者的确诊率分别为85%和80.0%。结果表明，该法检测肺结核患者血清CFP-10效能高，且能发现分枝杆菌培养漏检的患者。Szewczyk等[25]用电喷雾电离-串联质谱法分析了在分枝杆菌细胞壁结构中起关键作用的分枝杆菌酸。基于10个最丰富和最具特征的多反应监测对，对MTB和几株非结核分枝杆菌的粗脂肪酸混合物进行了有针对性的分析。该研究发现了分枝杆菌酸的独特特征，从而能够可靠地鉴定分枝杆菌种类。在对波兰结核病患者和非结核病患者的病例-对照研究中，该方法显示出了快速诊断活动性结核病方面的潜在价值，其敏感度和特异度均超过了现有方法。Nicoara等[26]建立并优化了一种基于选择性离子监测的气相色谱-质谱法，用于检测MTB细胞膜邻苯二甲酸甘油酯的热辅助水解和甲基化产物。研究发现，该方法的最低检出限为400 CFU/ml(CFU为菌落形成单位)，表明其可用于快速定量检测MTB，有可能应用于人类和兽医临床实验室，以快速诊断结核病。

(三)纳米技术

目前，随着纳米技术的不断发展，利用纳米材料的独特特性检测MTB生物标志物为结核病的诊断提供了更高效率和准确性。MPT64是MTB生长早期和中期产生的抗原，可诱导体液和细胞免疫反应。Thakur等[27]利用聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-碳纳米管纳米复合材料研制了一种检测MPT64抗原的电化学DNA适体传感器，发现15 min内检出MPT64的检出限为0.5 fg/ml，具有较高的敏感度和响应时间。Bai等[28]通过用信号适体标记金纳米粒子装饰的富勒烯-聚苯胺纳米复合材料(GNPs-C60-Pan)，构建了一种新型基于信号生成和放大的相对简单且超灵敏的电化学适体传感器，用于测定MPT64抗原。研究观察到MPT64的线性检测范围为0.02～1000 pg/ml，检测限为20 fg/ml，具有对目标抗原高选择性的特点。更重要的是，它对结核病患者血清样本中MPT64的检测也表现出良好的特异度和敏感度，为检测MTB感染提供了一种快速和高效的方法。Chen等[29]利用一种新型的由富勒烯纳米粒子、氮掺杂碳纳米管和氧化石墨烯组成的碳纳米复合材料(C60NPs-N-CNTs/GO)，研制了一种新型的夹心型电化学适体传感器。研究发现，在最优条件下该适体传感器对MPT64的线性检测范围为1 fg/ml～1 ng/ml，检测限低至0.33 fg/ml，并成功用于人血清中MPT64抗原的检测，显示出良好的应用前景。

目前，MTB抗原检测的纳米技术不断发展。与传统结核病检测方法相比，纳米技术具有更高的检测效能。尽管如此，构建一种快速、经济和便捷的检测临床标本的纳米技术，仍面临诸多挑战。高成本、复杂的仪器和技术要求限制了纳米技术在结核病高负担的低收入和发展中国家中的使用。因此，基于纳米材料的便携式结核病检测技术仍需不断发展。

三、问题与展望

综上所述，随着技术的进步，MTB抗原在检测技术和研究思路上都取得了较大的进展，但仍存在一些问题。首先，敏感度高的特异性抗体和相应的商业化试剂盒缺乏，虽有高效抗体报道，但仍局限于小样本研究，缺乏大样本量的临床评估。此外，痰液、支气管灌洗液和胸、腹腔积液等蛋白或细胞成分含量较高的临床标本中MTB抗原浓度低，检测困难。

MTB抗原研发的方向应注重多种特异性抗原同时检测。随着新型纳米材料和传感方法的发展，这些材料和传感方法可以通过增强各种因素，包括选择性、敏感度、长期稳定性、再现性和成本效益等，为结核病的快速诊断带来新的前景。随着特异性强、免疫原性好的抗原的不断发现和研究，在新的抗原富集方法和信号放大技术的支持下，MTB抗原检测必将得到新的完善和发展，并且因其在标本处理、操作步骤及仪器设备等方面具有优势而获得更多青睐。