关于水质分析标准方法验证要点的探讨

霍炜洁，李 琳，刘 彧，刘洪林，盛春花

(1.中国水利水电科学研究院标准化中心，北京 100038；2.山东省水文中心，山东 济南 250002)

“验证(Verification)”来源于拉丁语，演化自动词verificare(verify)，意为确定某物的真实性、准确性和有效性的过程[1]。ISO 17025：2017《检测和校准实验室能力的通用要求》[2]对“验证”进行了定义，指提供客观证据证明给定项目满足规定要求。项目可以是一个过程、测量程序、物质、化合物或测量系统等。标准方法验证是证实标准方法规定的要求已被实现的过程。从狭义上讲，是标准制定过程中对相关方法的技术指标进行确证的过程，为标准的科学合理和先进适用提供数据支撑；从广义上来讲，标准验证覆盖标准制修订和实施过程，即在标准的主要生命周期中验证其适用性、合理性和可操作性[3- 4]。

当前水化学分析技术发展日新月异，检测方法快速迭代更新，新方法新标准层出不穷。实验室采用新的标准方法前，首先要进行技术验证，验证是否能够按照方法要求开展实验，获得满意的实验结果。实验室管理相关标准，如ISO 17025：2017[2]、RB/T 214—2017《检验检测机构资质认定能力评价检验检测机构通用要求》[5]、CNAS-CL 01：2018《检验和校准实验室能力认可准则》[6]均对首次使用标准方法要求开展方法验证进行了规定，提出实验室引入标准方法前，需要验证是否能正确使用该方法，以此确保实验过程中方法的正确性。

方法验证是实验室获得某项检测能力的第一个环节，而且是系统性的能力确认，不仅需要识别相应的人员、设施环境、仪器设备等资源是否满足要求，而且还需要对标准方法的准确性和可靠性等技术指标进行验证，如检出限、定量限、标准曲线、正确度、精密度等。必要时还需要进行实验室间比对和能力验证，以证明具备该标准方法所需检测能力。如何做好方法验证，是考量实验室技术能力的关键。

1 分析系统验证

实施一项水质分析检测，从样品采集到出具检测数据是一项系统性工作，GB/T 32465—2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》[7]将影响检测结果质量的条件范围，包括仪器、试剂、操作程序、检测样品、工作人员、环境和质量保证措施等定义为分析系统。方法验证整体对应分析系统进行验证。

按照RB/T 214—2017[5]，实验室应对照标准方法的要求准备相应的仪器、标准物质、软件、试剂、参考物质、辅助设备如前处理装置等。对检测结果有影响或计量溯源性有要求的仪器，按照检定规程、校准规范或检测方法完成检定、校准或核查，并对计量溯源结果是否满足检测要求进行确认。核查方法要求的环境条件，包括样品采集、保存和运输环境要求以及检测过程环境要求，是否需配备通风、防震、降噪，无菌、控温、控湿设备设施等。依据标准方法确定实施方法验证人员的能力要求，其中包括采样人员、检测人员、仪器设备操作人员等，根据要求选择人员，组织人员进行新方法的宣贯和培训，培训后还需要对人员技术情况进行监督和记录。因方法验证是新技术、新方法的探索，在各项资源配备中，人员能力是实施方法验证的关键。验证人员应明确方法验证的目的、意义和标准方法实施过程中的风险点；掌握标准方法内容，熟悉所用试剂、器皿的要求并完成准备，掌握前处理步骤及注意事项、仪器调试及参数设定、上机操作步骤、数据计算、计算结果保留位数、记录表格设计等，还应掌握质量控制如空白试验、平行试验、结果分析与统计等要求。

分析系统的验证是确认实验室是否具备开展标准方法检测所需要的资源的验证，是确保获得正确的检测数据的前提。

2 方法性能指标验证

分析系统的验证确认满足要求后，可以开始对标准方法的技术指标进行验证。定量水质分析标准方法的典型技术指标包括检出限、定量限、灵敏度、选择性、线性范围、测量区间、精密度(重复性和再现性)、正确度等[7- 8]。本文选择关键技术指标方法检出限、校准曲线、正确度和精密度的验证要点进行探讨。

2.1 方法检出限验证

检出限指样品中可被(定性)检测，但并不需要准确定量的最低含量(或浓度)，是在一定置信水平下，从统计学上与空白样品区分的最低浓度水平(或含量)。检出限包括仪器检出限和方法检出限，方法检出限指用特定方法可靠地将分析物测试信号从特定基质背景中识别或区分出来时分析物的最低浓度或量，确定检出限时，应考虑到所有基质的干扰[8]。

随着检测技术高速发展，环境水体中痕量污染物不断被检出，痕量污染物的检出浓度普遍位于方法检出限附近。因此方法检出限在环境监测中尤为重要，方法验证得出的检出限水平也反映出实验室的检测能力。

关于检出限的文献报道和讨论很多，涉及检出限的定义、分类、计算以及数据统计等[9- 12]。如何正确或准确地估算检出限在国际分析领域一直存有争议。检出限的意义在于考察一个分析方法在低浓度范围的检测性能，基于不同角度而有不同侧重点。对于水质分析标准方法验证，通常倾向于更灵活以及更具有可操作性的计算方法。

方法检出限的计算方法主要包括空白平行测定标准差的倍数、逐步稀释法、最小检测能力计算等。测定方法、测定仪器设备、空白样品目标组分检出情况不同，方法检出限的计算方法和表达方式也不同。

利用空白平行测定标准差的倍数方法计算检出限是最常采用的方法。HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》[13]中方法检出限一般确定方法的计算演化自美国EPA方法。当空白试验中检测出目标物，重复7次以上，即n大于等于7次空白试验，可按下式进行计算：

MDL=t(n-1，099)×S

(1)

式中，MDL—方法检出限；n—样品的平行测定次数；t—自由度为n-1，置信度为99%时的t分布值(单侧)；S—n次平行测定的标准偏差。

使用该方法的前提是空白试验中能检出目标组分，且任意测定值之间可允许的差异范围为“空白试验测定值的均值±估计检出限的1/2”以内。若空白试验值超出了允许的差异范围，应对所用试剂的纯度以及仪器的灵敏度和稳定性进行核查。若空白试验中未能检出目标组分，则需要预估检出限，向空白样品中加入估计方法检出限3～5倍的目标组分，重新测定，按上式计算检出限，判断检出限的合理性。如果目标组分浓度不在计算出的方法检出限3～5倍范围内，则需调整样品浓度，重新测定。

SL 219—2013《水环境监测规范》[14]对检出限的规定参考了《全球环境监测系统水监测操作指南》。其规定给定置信水平为95%时，样品测定值与零浓度样品的测定值有显著性差异即为检出限。每次对空白试验进行平行测定，当空白测定次数少于20次时，计算公式如下：

(2)

式中，MDL—方法检出限；tf—显著水平为0.05(单侧)，自由度为f时的t值；Swb—空白平行测定(批内)标准偏差。当空白测定次数大于20次时，按如下公式计算：

MDL=46×Swb

(3)

该方法的前提也是需要空白样品的测定值不能为零，若仪器分辨力低，空白样品测定值为零则可配置接近于零浓度的实验用水进行测定和计算。

值得注意的是，该方法中计算的空白标准偏差应为批内标准偏差，祝旭初[9]以《土壤和沉积物铍的测定石墨炉院子吸收光度分析法(征求意见稿)编制说明》方法验证报告为例，进行了检出限计算方式的探讨。方法验证报告中采用空白批间标准偏差计算检出限，批间影响高度显著，建议应在尽量相同的试验条件下，在尽可能集中的时间间隔内完成测定，由于计算批内标准偏差确定检出限的方法纳入了时间和试验环境条件的影响，因此采用空白批内标准偏差计算检出限更具有统计意义。而且样品分析、标准曲线制定和空白测定亦应同步进行。

除了较常采用的空白标准偏差倍数法，GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》[8]还列举了目视评价法、校准方程参数评估法、信噪比法。目视评价法通过绘制阳性(或阴性)结果百分比与浓度相对应的反应曲线确定阈值浓度，类似于逐步稀释法。校准方程参数评估方法和信噪比法主要用来评估仪器的检出限。HJ 168—2020还对分光光度法、滴定法、离子选择电极法、微生物计数法等方法的检出限计算进行了规定。

对于判定方法检出限验证的结果是否满足要求，GB/T 32465—2015[7]进行了规定，若标准方法给出方法检出限，则在给出的方法检出限浓度水平上，通过分析该浓度水平的样品来验证方法检出限，分析结果应在给出的方法检出限的±20%范围内，若未给出方法检出限，实验室应选用合适的方法研究或计算表示。在实验室实际方法验证过程中，通常是根据分析技术方法的特点选择检出限计算方法，然后与标准方法的检出限进行比较，这种情况下需选择合适的计算方法，还应注意所选方法的适用条件。

2.2 校准曲线验证

校准曲线通常以测得的待测物浓度或含量为横坐标，以各浓度点对应的如吸光度、峰高、积分峰面积等仪器响应信号值为纵坐标绘制标准曲线。用线性回归方程计算校准曲线的相关系数、截距和斜率。校准曲线的斜率体现了方法的灵敏度，环境条件、试剂、仪器运行条件等因素的变化会在一定程度上影响校准曲线。

通常按照标准方法校准曲线设定的浓度点进行验证，标准方法中有明确要求的，验证应以满足标准方法要求为主，如HJ 503—2009《水质挥发酚的测定4-氨基安替比林分光光度法》[15]就对校准曲线回归方程相关系数要求达到0.999以上。标准方法中没有对相关系数进行要求，可参考GB/T 32465—2015[7]的规定，在方法规定的工作范围内确定校准曲线的各个浓度点，浓度点个数应在校准曲线浓度范围均匀布置6个或以上的校准点，不同浓度的校准点应该单独配置，不能通过稀释同一个母液获得，相关系数r不小于0.997。校准曲线应与样品同时测定，且要定期确定校准曲线是否稳定，即在不同时间，制作同一条曲线的重复性。

行业标准也进行了规定，SL 219—2013[14]中规定相关系数绝对值宜大于0.999，使用校准曲线时，测试样品浓度宜控制在曲线的20%～80%范围内。HJ 168—2020从制定标准方法的角度，要求包括零浓度在内6个校准点，定量方法线性回归方程相关系数不低于0.999。

校准曲线的确认除了相关系数外，必要时还需要进行斜率和截距的检验，如果标准方法要求校准曲线通过零点，还应进行是否通过零点的检验。

2.3 正确度验证

正确度指无穷多次重复测量所得量值的平均值与一个参考量值间的一致程度[16]。在描述测量准确程度时，也会使用到准确度的概念，准确度指被测量的测得值与其真值间的一致程度。当测量提供较小的测量误差时就说该测量是较准确的。“测量准确度”不宜用于表示“测量正确度”。测量准确度当用于一组测试结果时，由随机误差分量和系统误差分量组成[17]，因此测量准确度与正确度和精密度有关，测量正确度和精密度用来衡量测量的准确度。

正确度的高低体现了试验过程中系统误差的大小。实验室验证正确度，通常采用有证标准物质或标准样品核查，以及回收率测定的方式，也可采用参加能力验证、与经典方法或公认方法进行比对的方式。

采用有证标准物质或者有证标准样品验证测量的正确度，通过重复性检测，分析重复测定值的平均值与接受参考值的偏差，偏差不得超过±10%，或者使用统计分析方法，比较检测结果平均值与参考值是否有显著差异，确认这种差异是否可以被接受[7]。较常用的方法是测定有证标准物质或标准样品，结果偏差小于不确定度即说明测定结果是准确可靠的[18]。

采用加标回收率方法验证正确度，最理想的是使用与样品的基质匹配且浓度相近的有证标准物质或标准样品进行实验。若没有有证标准样品，可选择替代物来进行回收率实验。不同加标浓度，回收率可能不同，通常加标浓度越低，回收率越低，设定加标浓度宜覆盖整个测试范围的目标组分浓度。GB/T 27417—2017[8]标准给出了不同浓度水平范围对应的回收率范围，并强调了回收率试验样品应与实际样品的基质匹配，因此加标回收试验不是简单的空白样品加标回收试验，而是实际样品的加标回收试验。HJ168—2020[13]也对正确度验证进行了明确的规定，但该标准中未给出回收率评价范围。SL 219—2013[14]附录A中列出了地表水、地下水、大气降水、污废水等不同常见检测项目，在推荐监测分析方法下，不同样品含量范围对应的准确度允许差，可供评价参考。

2.4 精密度验证

精密度指在规定条件下，独立测试结果间的一致程度[17]。精密度大小体现了试验过程中随机误差的大小。随机误差不可避免，而产生随机误差的因素也不能完全控制，诸如检测人员、仪器设备、环境条件、测量时间间隔等。精密度通常用标准偏差来表示。

重复性和再现性检测条件下的精密度是不同的。重复性体现了测定结果的短期变化。方法重复性可以通过准备不同浓度的样品或浓度与做回收率相近的样品，在较短的时间间隔内由同一个分析员进行分析测定，得到标准偏差。必要时需要验证再现性条件下的精密度，确认再现性时，应尽可能涵盖时间、人员、试剂、环境条件及其他不可控的微小因素的影响。标准GB/T 32465—2015[7]也给出了不同浓度或含量的样品期望精密度，可用以评价实验室测定的精密度。

精密度与正确度相同，不同的样品基质以及不同的分析物浓度，精密度可能会存在差异。因此精密度评估需要选择每个类型代表性的样品进行测定，而且一个方法的精密度通常会随着分析物浓度降低而变差，也应该考虑在不同浓度点进行精密度的验证。

HJ 168—2020规定通过有证标准物质和实际样品测定，计算平均值、标准偏差、相对标准偏差。也可采用实际样品基体加标进行验证。

水利行业是通过精密度偏性试验确定实验室测试结果的精密度。SL 219—2013[14]规定对空白溶液(试验用纯水)、0.1C标准溶液(C为检测上限浓度)、0.9C标准溶液、实际水样、0.5C实际加标水样(临用前配制)5类样品，每日1次平行测定，共测6次。比较各组溶液的批内变异与批间变异，检验变异的差异性。比较实际水样与标准溶液测定结果的标准差，判断实际水样中是否存在影响测定精密度的干扰因素。附录A中列出了地表水、地下水、大气降水、污废水等不同常见检测项目，在推荐监测分析方法下，不同样品含量范围对应的精密度允许差，可供评价参考。

通常计算标准偏差要有足够多的测量次数，计算时按统计方法要求剔除异常值，再进行标准偏差的计算。

3 结语

水质分析标准方法有其共性特征，也有检测不同目标组分对应的特殊要求，而且不同时期发布的水质标准方法，其内容设置、技术指标以及质量控制措施也不尽相同。由于标准方法验证是证实标准方法规定的要求已被实现的过程，因此，水质分析标准方法验证技术指标还应以标准内容为主，参考普适性的国家标准要求和行业特殊要求。标准在实施过程中也会不断更新、完善，当标准方法修订后重新发布，新标准应用到新的基质，样品前处理过程、检测的仪器设备、标准的关键步骤等要素发生变化，均应该针对变化内容进行再验证。

标准方法验证具有系统性、持续性特点，涉及检测过程中人、机、料、法、环、测各个环节，本文从仪器设备、环境条件和人员能力等资源性验证要求到标准方法典型技术指标的验证要点进行了探讨，以期推动水质分析标准方法验证工作有效开展。