EDNRB基因在Waardenburg综合征发病中的作用研究进展

吴俪媛陈梦冰李梦华邱士伟乔月华张岩时晰,*

1徐州医科大学听觉与平衡医学研究所(徐州 221004)

2江苏省人工听觉重点实验室(徐州 221004)

3徐州医科大学附属医院临床听力中心(徐州 221006)

4福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(福州 350005)

5暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院）(深圳 518020)

6吉林大学白求恩第一医院耳鼻咽喉头颈外科(长春 130021)

Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome，WS)，又被称为听觉-色素综合征，它是引起综合征性耳聋的最常见的原因之一，与2%-5%的先天性耳聋病例有关。WS遗传方式主要为单基因致病的常染色体显性遗传伴不全外显[1,2]。WS属神经嵴疾病之一，是由于神经嵴细胞发育异常而导致的一组临床症候群。荷兰眼科学家及遗传学家Waardenburg[2]于1951年首次报道并以其名字命名该综合征。

全世界范围不同人种及不同性别均有病例报道，据推测白色人种WS人群发病率为1/42 000，占先天性耳聋的1.43%。在我国，杨淑芝等[3]对来自18个省份（自治区）及2个直辖市的30个聋校或聋儿康复机构的2466名在校学生进行抽样调查，共采集到WS病例17例，构成比为0.69%；其中Ⅰ型病例9例，Ⅱ型病例8例，未收集到Ⅲ型和Ⅳ型病例，我国先天性聋哑儿童患者中WS患者可能比国外少，但目前缺少对WS的大规模流行病学调查研究。

目前根据附加体征，WS病例被进一步分为4个亚型。Waardenburg综合征I（WS1）伴內眦异位，Waardenburg综合征II（WS2）不伴內眦异位，Waardenburg综合征 III（WS3）合并上肢异常，又称Klein-Waardenburg综合征，Waardenburg综合征VI（WS4）常伴先天性巨结肠等胃肠道畸形及周围神经脱髓鞘病变、中枢髓鞘形成障碍等神经病学改变，又称Waardenburg-Shah综合征。根据W指数可以区分两种类型：W>1.95为WS1，W<1.95为WS2[4]。

目前的研究发现，与WS明确相关的基因有6个，分别为MITF、PAX3、EDNRB、EDN3、SOX10及SNAI2，这些基因相互作用，在疾病的发生和发展中占有不同地位[5-7]。EDNRB（endothelin receptor type B）基因即内皮素受体B型基因，对神经嵴发育的起到调控作用，其蛋白属于G蛋白偶联受体(G Proteincoupled receptor,GPCR)的视紫红质超家族。在EDNRB中，纯合子和不太频繁的杂合子突变导致WS2和WS4的产生[8]。本文主要对EDNRB基因在Waardenburg综合征中所扮演角色予以详细综述。

1 EDNRB基因及其蛋白结构的概述

EDNRB基因和蛋白质在脊椎动物中呈高度保守状态[9]。人源性EDNRB基因位于13号染色体上，其含有7个外显子和6个内含子。人源性EDNRB全长442氨基酸，预测分子质量约为50kDa，与EDNR序列同源性为64%。小鼠、大鼠、牛、山羊和猪的EDNRB长度在441-443个氨基酸范围内，与人EDNRB具有高度的序列同源性[10]。EDNRB在许多组织中均有表达，特别是在结肠粘膜下层的肌间神经丛、粘膜层、神经节和血管中表达较高[11]。

EDNRB蛋白属于GPCR的视紫红质超家族，由一个长的胞外末端序列、7个螺旋跨膜结构域(Transmembrane domains,TMDs)、3个细胞外环和3个细胞内环以及一个细胞质C末端组成。其中TMD I-III和VII以及相邻的细胞外回路构成了激动剂结合结构域。TMD IV-VI和邻近的细胞外环参与受体的选择性结合，与羧基末端尾部构成信号传导域。EDNRB的翻译后修饰主要包括棕榈酰化、磷酸化和潜在的糖基化。定点突变和[3H]棕榈酸研究结果表明，人源性EDNRB羧基尾部存在三个半胱氨酸残基(Cys402、403和405)是潜在的棕榈酰化位点。C端棕榈酰化程度可能影响与G-蛋白的偶联及影响下游信号通路和EDNRB磷酸化。目前已经确定了13个磷酸化位点，主要集中在C端(435-442AA)。EDNRB磷酸化可能会影响受体功能，GPCR激酶(GRKs)或β-arrestins在第三细胞质环和/或C末端尾部的磷酸化可能参与受体脱敏。EDNRB在Asn59含有糖基化位点，但似乎不影响配体结合[10]。EDNRB对EDN1、EDN2和EDN3这三个配体都有很高且相似的亲和力。虽然EDNRB可以结合这三种内皮素，但对EDN3和EDNRB人和小鼠突变体的相似表型的观察表明，EDN3是EDNRB的主要生理配体[12]。EDNRB与其配体之间的相互作用面积较大，这就很好地解释了EDNs的异常高的亲和力。EDNs结合诱导受体的构象发生变化，从而导致效应器的激活以及内化，EDNRB内化的作用是导致受体和配体的降解[9]。

2 EDNRB基因对神经嵴发育的调控作用

神经嵴细胞（neural crest cells，NCC）是胚胎发生早期，起源于神经管背侧的多能迁移细胞。学术界，根据NC细胞在前后胚轴上的初始位置，已经确定了四个NC细胞亚群，这些细胞在发育过程中聚集在胚胎的各个区域，并参与不同组织和器官的形成。根据类别和局部模式信号，NC细胞可以分化成多种谱系，包括黑素细胞、神经内分泌细胞和各种结缔组织，包括颅面骨骼的骨和软骨，以及心脏近端流出道的平滑肌、外周神经系统的一些神经元和胶质细胞，以及肠神经系统的所有神经元和胶质细胞[9]。

大量的研究已经证实内皮素介导的信号在神经嵴衍生细胞系的发展中起着至关重要的作用。在脊椎动物中，EDNRB首先在神经管的背端表达，然后在NCC的背腹侧和背侧通路上表达[12]。Shin等[11]在1999年建立了一种能诱导表达EDNRB的小鼠。证明EDNRB信号通路在E10和E12.5小鼠胚胎中，对于黑素细胞和肠道神经母细胞前体的起始和正确迁移至关重要。此外该信号通路对小鼠黑素细胞的存活、增殖和/或迁移起到关键调控作用，但对于迁移前增殖或能否决定迁移并非必要条件。此外，靶向敲除小鼠EDNRB基因实验同样证实EDNRB在黑素细胞和肠道发育中发挥了关键作用[12]。

3 EDNRB基因突变与Waardenburg综合征的联系

1951年，Waardenburg的研究结果发表在《美国人类遗传学杂志》上，定义了现在被命名的I型Waardenburg综合征[13]。WS是一种常见的综合性耳聋，其特征是皮肤、头发、眼睛和耳蜗血管纹中缺乏NCC衍生的黑素细胞[11]。

WS2主要表现为先天性感音神经性聋和色素异常，直到1971年，Arias[13]才发现了Waardenburg综合征的这一独立分支，他将其命名为II型。WS2诊断的临床标准至少描述为以下两种：先天性感音神经性聋、白额、虹膜完全或节段性异色、发育不良的蓝眼、早期灰化和一级亲属受累[14]。WS4又称Waardenburg—Shah综合征或Waardenburg—Hirschsprung病，其主要特征为患者常伴先天性巨结肠或胃肠道闭锁，部分WS4病例可出现神经症状，包括周围神经病变、智力迟钝、小脑共济失调和四肢痉挛[2]。迄今为止，大约5%的WS2和25-35%的WS4病例报告了EDNRB和/或EDN3突变[9]。

Doubaj等[15]报告了一个3个月大的摩洛哥女孩，其患病类型为WS4型。患者有3个表亲在婴儿期死亡，症状相同。Sanger测序的分子分析表明，EDNRB基因的外显子6中发现了一种纯合子错义突变c.1133A>G(P.Asn378Ser)，这一变化导致了天冬酰胺-378残基被丝氨酸残基所取代，从而导致胺基取代羟基，引起疾病的发生。Loupe等[16]的研究发现患者在RPS6KA3的第289密码子发现了一个新的2 bp缺失(c.865_866delCA)，导致RSK2的框架移位和过早终止，使整个EDNRB基因的杂合缺失，导致父亲、一个儿子和两个女儿患有WS4。Sangkhathat等[17]的研究发现EDNRB基因在外显子2的第196密码子检测到一个纯合错义突变(Ser196Asn)，即该密码子的第二个核苷酸发生的变化可能会导致氨基酸天冬酰胺取代丝氨酸从而引发WS4。Syrris等[18]用标准的DNA突变分析和测序技术筛选了一个结合WS-HSCR表型的家族，以了解EDNRB位点的突变，其在密码子253(CGA→TGA，Arg→STOP)上发现了一个新的无义突变。这种突变导致EDNRB在第3外显子的翻译过早结束，并预测它会产生一个截短的非功能的EDNRB从而导致WS4。Ohtani等[19]研究了WS4小鼠，是模拟人类WS4的动物模型，在此研究中，作者检测了WS4小鼠Ednrb基因的基因组序列，发现该基因有598bp的缺失。被删除的区域包含外显子2的整个区域和外显子3的5'端部分，并且两侧是反向重复序列，这被认为是触发删除的原因。因此作者认为Ednrb基因的缺失是WS4小鼠表型突变的主要原因。Matsushima等[20]报道了另一种WS4小鼠模型，由于外显子2和3的缺失，它们的Ednrb缺乏编码Ednrb跨膜结构域的318个核苷酸。内皮素3及其受体之间的相互作用是黑素细胞和奥尔巴赫丛细胞正常分化和发育所必需的。所以该文献的结论是，这里缺失的相互作用导致了这些细胞的缺乏，进而导致了WS4小鼠的色素沉着异常、耳聋和巨结肠。

Somashekar等[21]在携带纯合突变的先证者中观察到EDNRB的另一新的突变类型c.673G>A[p.（Gly225Ser）]，患者表现为WS2的特征且无先天性巨结肠表征。Issa等[14]筛选了49例疑似WS2诊断的EDNRB突变或缺失患者，先前发现MITF和SOX10突变阴性。在这个系列中，作者在EDNRB中发现了四个新的杂合突变，且在主要数据库中均未见报道。在家系2中，作者发现c.50T>c变异导致信号肽中的p.Leu17Pro改变，可以通过SIFT（有害，得分：0.03）和 MutationTaster软件（致病，p：0.607）来预测，而不能通过PolyPhen-2软件（良性，得分：0.332）来预测。在家系3中，作者发现c.467C>G变异导致第二跨膜结构域的p.Pro156Arg改变，这三个预测软件均判断为“高致病性”（SIFT有害，得分：0；MutationTaster：致病，p：1；PolyPhen-2：损伤，得分：0.999）。在家系4中，一个内含子变异c.484-5T>G，被预测改变外显子2上游的剪接受体位点。最后，在家系5中发现的变异，c.678G>A，被预测截断蛋白质（p.Trp226*）。

通常来说EDNRB突变导致WS2或者WS4，但随着研究的深入，越来越多证据表明EDNRB突变同样与WS其余的类型有关联。Cheng等[4]的研究表明，EDNRB基因变异在一个患有WS1的中国家庭中被发现。按照WS的评定标准，19岁男孩，其姐及一名旁系亲属被确诊。先证者EDNRB基因外显子2编码区发现一个错义杂合突变。在先证者患病的旁系亲属和姐姐身上也发现了同样的突变。随后的研究证实EDNRB中的c.469A>G杂合突变可能致具有病性。这是中国WS1患者中首次报道EDNRB突变为潜在的致病突变。Morimoto等[22]的研究发现一列先证者EDNRB基因中有一个纯合错义突变(p.R319W)而导致的WS1。p.R319W突变EDNRB的模型显示该区域带正电荷的表面积减少，这可能降低EDNRB与G蛋白的结合能力，并导致WS表型下的异常信号转导。

4 发病机制

目前较为认可的WS发病机制有两种学说：单倍体剂量不足学说和显性负效应学说，但二者只能解释部分WS发病机制。其中单倍体剂量不足学说认为基因杂合突变中，两个等位基因中的一个突变基因（无义突变、移码突变和错义突变）导致其所编码的蛋白质失去正常功能或保留部分功能，另一个野生型基因编码的蛋白质的量不能达到两个正常等位基因编码的蛋白质行使正常功能所需生物量的阈值，从而造成突变基因编码的蛋白质不能发挥正常的生理功能。不同个体症状严重程度的差异可能是由于残留的正常野生蛋白量的不同以及不同个体不同器官中黑色素细胞发育所需野生蛋白量不同所致。EDNRB基因突变可因为单倍体剂量不足效应导致WS。显性负效应学说主要认为，在两个等位基因中如果一个基因突变，另一个基因保持野生型，即使突变的基因完全失去功能，理论上这一对等位基因仍应保留50%功能。但某些情况下突变的蛋白质不仅自身不能发挥正常生理功能，还使正常蛋白质也不能发挥功能，这种蛋白质相互作用中的干扰现象称为显性负效应。EDNRB基因突变同样存在因显性负效应抑制野生蛋白功能最终导致WS的可能性[23,24]。

综上，EDNRB基因的一些突变导致蛋白表达的下降、蛋白质相互作用的干扰和ETBR功能的丧失，继而影响黑素细胞的增殖和分化。黑素细胞被认为是血管纹的中间细胞，该细胞发育不良或减少，将会影响耳蜗血管纹分泌内淋巴的功能，进而引起听力损失从而引起WS。

5 展望

经过学者多年的研究，WS的分子遗传背景得到了极大的丰富。尽管目前发现的EDNRB突变数量不断增加，但对EDNRB突变导致WS的发病机制尚不明确。从神经嵴发育到黑素细胞发育是一个非常复杂的网络调控过程，EDNRB突变在这个网络中的具体调控作用以及在调控中与其他蛋白的相互作用仍不明确。在WS发病中遗传背景、基因修饰、环境因素等因素可能同样具有重要意义，这些为今后研究WS发病机制提供了更多的潜在思路和研究方向。

目前人工耳蜗的植入是治疗耳聋的一种较为普遍的手段，关于WS患者人工耳蜗植入效果的报道不多，尽管大部分现有报道表明术后效果良好，与其他耳聋无明显差别，但仍有一些研究认为部分WS患者术后效果不佳[25]。因此深入研究WS的发病机制，为彻底解决WS临床治疗难题奠定必要理论基础。