注射用聚山梨酯80大分子杂质参与类过敏反应的可能机制

2022-11-24韩依伦段金连段为钢

空军军医大学学报 2022年3期

夏恒，韩依伦，段金连，段为钢

(云南中医药大学中医药学分子生物学重点实验室，云南昆明 650500)

对于以挥发油或其他脂溶性物质为主要成分的注射剂而言，聚山梨酯80是这类注射剂引起类过敏反应的主要物质基础，典型的是鱼腥草注射液[1]。目前国家对含聚山梨酯80较多的中药注射剂，如鱼腥草注射液等一直处于管制状态。针对这种情况，在研究聚山梨酯80的杂质安全性问题上，必须对聚山梨酯80导致类过敏反应的物质基础及类过敏反应发生的可能机制进行深度解析，从固有免疫方面揭示聚山梨酯80诱导类过敏反应的可能机制，从根源上解决我国目前注射剂的窘境。

1 聚山梨酯80及其在注射剂中的作用

聚山梨酯80，化学名是聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，为淡黄色至橙黄色的黏稠液体，是一种非离子型表面活性剂，易溶于水、甲醇、乙醇和醋酸乙酯，因亲水性强，广泛用作难溶性药物的增溶剂、乳化剂和稳定剂[2]。因聚山梨酯80的毒性相对较小，已载入多国药典中。在国家食品药品监督管理局目前公开的132个中药注射剂品种资料中，使用聚山梨酯80的中药注射剂就有37种，其制剂用量在0.1%～2.0%之间，相较于化药、生物制剂，用量较大，因此，认为这是聚山梨酯80国内类过敏反应报道明显多于国外的主要原因之一。

据文献报道，临床上中药注射剂所导致的不良反应以类过敏反应为主。类过敏反应主要特点是没有潜伏期和致敏过程，药物首次进入人体后，数分钟或30 min内出现过敏反应，且与使用剂量、浓度显著相关[3]，用量越大，反应越快，症状更明显，呈现出明显的“量-时-效”关系，且静脉给药更敏感[4]，没有抗体产生或淋巴细胞的参与，只发生于接受治疗剂量药物的少数个体，并且患者血清中的IgE浓度也未见明显升高，即可产生过敏样症状，表现为：局部皮肤如头面胸部及四肢的血管扩张、红斑、水肿等症状；消化系统出现流涎、恶心、呕吐、腹泻等症状；心血管系统出现心悸、血压升高等症状；呼吸系统出现胸闷、呼吸困难等症状，严重时会发生呼吸衰竭，出现休克，甚至死亡[5]。从免疫和炎症的角度看，这种类过敏反应实际上是机体对侵入体内的大分子物质的共性反应。

2 中药注射剂导致类过敏反应的物质基础不清楚

对于中药注射剂，刘婷等[6]采用Beagle犬动物模型静脉给药聚山梨酯80和含聚山梨酯80的鱼腥草注射液后，均出现了强烈的类过敏反应，而注射去除聚山梨酯80的鱼腥草注射液则无类过敏反应发生，表明鱼腥草注射液所导致的类过敏反应与其增溶剂聚山梨酯80存在一定关系。此外，张美玉等[7]通过对鱼腥草注射剂导致Beagle犬发生不良反应的研究发现聚山梨酯80可能是鱼腥草注射剂引起类过敏反应的物质基础。闫位娟等[8]证明了含聚山梨酯80的中药注射剂可导致犬的强阳性类过敏反应，研究表明聚山梨酯80通过诱导细胞产生脱颗粒作用，引起组胺等过敏活性物质释放进而诱发类过敏反应。各种研究都认为含聚山梨酯80的中药注射剂导致类过敏反应的物质基础是辅料聚山梨酯80，但事实是这样吗？其实不然。

3 聚山梨酯80大分子杂质是参与类过敏反应的物质基础

3.1 聚山梨酯80中的大分子杂质

我们课题组根据对含聚山梨酯80的注射剂导致的类过敏反应的研究，以及通过动物实验验证了注射用辅料聚山梨酯80去除大分子杂质后其安全性得到极大的提高，从大分子杂质角度回答了注射用聚山梨酯80存在的安全性问题，认为类过敏反应与大分子杂质有关，创新性提出“大分子杂质理论”[9-10]，按照吸收的一般规律，分子量越大则口服吸收越小，一般认为分子量超过3 000的物质是极难吸收的，即导致类过敏反应的物质主要是口服不吸收的物质，如果按照大小分子归类，大分子则属于口服不能直接吸收的物质[11]。聚山梨酯80大分子杂质引发的不良反应主要发生在注射剂，且静脉注射更为严重，而某些口服药和皮肤黏膜外用药(如鱼腥草合剂)含有较多的聚山梨酯80，但罕见类过敏反应报道，说明消化道机械黏膜屏障能阻拦这种引起类过敏反应的大分子物质进入机体[11]。

根据结构通式计算，聚山梨酯80的Mr为1 309，且无共轭体系，因此聚山梨酯80应该为无色物质，但在实际生产加工中聚山梨酯80为黄色黏稠液体，间接说明它是含有其他颜色的杂质[12]，我们课题组用超滤管截留实验也证实，注射用聚山梨酯80含有大量Mr超过10 000的杂质，占总量的80%以上[13]。

3.2 聚山梨酯80中的小分子物质

目前的注射剂(包括注射用辅料)生产工艺会无针对性地去大分子杂质(物质)。对于以聚山梨酯80为增溶剂的中药注射剂和其他注射剂而言，聚山梨酯80是大分子杂质(物质)的重要来源。课题组在其他中药注射剂方面的实验研究证明，去除大分子物质能在保障中药注射剂主要功效和主要物质基础不明显改变的前提下，显著提升中药注射剂的安全性和稳定性[14]，也证明了去除聚山梨酯80中的大分子杂质，在临界胶束浓度以下的增溶能力更好，安全性也得到了较大的提高[13,15]。

因此，我们明确提出注射剂导致的不良反应是类过敏反应，其中导致类过敏反应的物质基础是聚山梨酯80中的大分子杂质。

4 聚山梨酯80大分子组分(杂质)参与类过敏反应的可能机制

注射剂的类过敏反应可用免疫反应来解释，免疫反应分为固有免疫反应和适应性免疫反应。固有免疫反应的特点是首次接触即可发生，类过敏反应主要属于一种固有免疫反应。根据机体处理外源性物质的特点，外源物质可分为大分子物质和小分子物质。由于皮肤屏障的存在，在正常情况下，不挥发的物质只能从消化道入侵，由于消化液和肠道屏障的存在，大分子物质要么被分解为小分子物质，要么被屏障阻止，即使有小分子物质入侵，大多能被肝脏代谢灭活最终排出体外，这也是中药口服不良反应远小于并少于注射给药的原因。在正常情况下，大分子物质无法进入机体，但注射给药则突破了相应的固有免疫屏障而进入机体，引发相应的安全性问题。

聚山梨酯80大分子组分的入侵必然激活免疫系统(固有免疫)，这些大分子本身无毒害性，但作为外来物质，容易被固有免疫系统识别为病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)而引发过激反应，最终导致类过敏反应发生，聚山梨酯80中的大分子杂质更符合PAMP[16]。

4.1 聚山梨酯80 PAMP的可能信号通路

PAMP是指一类或一群特定病原菌(及其产物)共有的某些非特异性、高度保守且对病原体生存和致病性必要的分子结构，不存在于人类，可被固有免疫细胞的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)所识别。PRR是一类表达于固有免疫细胞表面、内体、溶酶体、细胞质中可识别PAMP/DAMP的识别分子，PRR与PAMP/DAMP结合后，可以迅速激活效应细胞，产生快速的生物学反应。

4.1.1 C反应蛋白肝脏合成的急性期蛋白，为五聚体蛋白短分子家族，识别细菌细胞壁磷酰胆碱，亦具有调理作用、参与补体激活及促炎作用。

4.1.2 甘露糖结合凝集素主要在肝脏合成，作为急性期反应蛋白存在于血浆。这种可溶性受体与病原菌的相互作用可通过调理作用促进巨噬细胞吞噬；活化补体甘露糖结合凝集素MBL途径最终消灭病原菌，并诱导其他的细胞免疫应答。

4.1.3 Toll样受体(Toll-like receptor，TLR) 一类跨膜受体，仅识别表达在病原微生物上的高度保守的结构基序，通过识别并结合相应的PAMP或DAMP，活化细胞并表达一系列免疫效应分子，在免疫应答及炎症反应中发挥重要作用[17]。TLR的信号转导依赖于胞浆区的接头蛋白分子、蛋白激酶和转录因子。TLR广泛分布于多种组织和细胞中，在各种免疫细胞中都有表达，可以识别脂类、蛋白类、核酸类的PAMP[18]。当TLR通过识别PAMP被活化时，经由TLR传递的信号激活NF-κB等转录因子，引起多种细胞因子和趋化因子的合成和分泌，诱发炎症反应并介导巨噬细胞和中性粒细胞向炎症部位浸润[19]。

4.1.4 甘露糖受体 C型凝集素受体家族，主要表达于巨噬细胞表面，为单链跨膜分子，作为一个固有的PRR，是一种重要的抗原提呈分子和信号转导受体。可识别并结合微生物细胞壁糖蛋白和糖脂组分中的末端甘露糖和岩藻糖残基，从而介导巨噬细胞的吞噬作用[20]。

4.1.5 清道夫受体一大类结构多样的跨膜糖蛋白，其主要分布在巨噬细胞、树突状细胞和血管上皮细胞等免疫细胞表面，可通过结合各种模式配体而促进非己成分和自身修饰后成分的清除。可识别氧化的低密度脂蛋白、革兰阳性菌脂磷壁酸、革兰阴性菌脂多糖和完整细菌PAMP，机体衰老、突变或凋亡的细胞的DAMP，从而有效清除血液循环中的细菌和受损细胞[21]。

4.1.6 RIG-I样受体家族细胞质中的一类RNA解旋酶，属于固有免疫的PRR，其可以结合病原相关分子模式及RNA配体识别非自身的病毒RNA，激活RIG-I信号通路[22]，促进细胞因子产生，激发机体抗病毒反应，抑制病毒复制和清除感染细胞。

4.1.7 NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)家族分布在细胞质中，可识别细胞质中不同的PAMP，是抗细胞内病原菌感染的固有免疫信号通路中重要的受体。NLR的C端为LRR，主要负责识别和结合特异的PAMP和DAMP[23]。

4.1.8 NLRP亚家族与炎症小体 NLRP是NLR中最大的亚家族，其中以NLRP3研究较多。NLRP3主要表达在巨噬细胞、外周血白细胞，N末端含有PYD效应结构域，可识别并结合MDP、细菌、mRNA等PAMP和细胞外ATP等DAMP，使NLRP3发生构象改变，暴露NOD结构域，继而寡聚化，并通过PYD-PYD相互作用募集凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated seck-like protein containing CARD，ASC)接头分子，形成含有NLRP3、ASC、Cardinal和caspase-1的炎症小体[24]。ASC通过CARD-CARD相互作用募集产生caspase-1，裂解pro-IL-1β和pro-IL-18，产生炎性细胞因子IL-1β和IL-18。目前已鉴定的炎症小体有4种，分别为NLRP1炎症小体、NLRP3炎症小体、IPAF炎症小体和AIM2炎症小体，它们都含有ASC、caspase蛋白酶以及一种NLR家族蛋白或HIN200家族蛋白，并且最终可激活caspase-1和参与炎症反应的细胞因子[25]。

4.1.9 DNA识别受体家族 DNA识别受体包括DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DNA-dependent activator of interferon regulatory factor，DAI)和DNA依赖性RNA聚合酶Ⅲ(polymerase Ⅲ，PolⅢ)等，可以识别细菌或病毒的DNA。DAI能够直接结合dsDNA，诱导Ⅰ型干扰素的分泌，继而正反馈诱导DAI的表达[26]。PolⅢ能够介导胞质DNA的识别，并诱导产生IFN-β，最终激活机体固有免疫应答，参与病毒的清除。

4.2 损伤的主要方式

4.2.1 激活补体系统聚山梨酯80诱发类过敏反应的临床和实验研究发现，在脂质体、静脉药物的胶束载体(聚氧乙烯蓖麻油、泊洛沙姆188)、静脉造影剂这类物质引起的类过敏反应中，补体系统的激活均起着至关重要的作用，将其统称为补体激活相关类过敏反应[27]。

补体系统激活过程依据其起始顺序不同，可分为经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素途径3条途径。补体是固有免疫中一类可溶性模式识别分子。补体系统广泛参与了机体抗微生物防御反应以及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学作用的效应系统和效应放大系统，补体过度激活可引起肥大细胞脱颗粒，产生过多炎症介质，其介导的类过敏反应是过敏性反应类型中的重要组成部分[28]。

国外学者发现小鼠Mrgprb2受体和人体同源MRGPRX2受体参与肥大细胞促分泌活动，在类过敏反应中发挥关键作用[29]。此外，补体系统激活是参与类过敏反应发生的重要机制。SZEBENI等[30]研究证明SC5b-9是补体系统激活的最终产物。SC5b-9为补体系统的末端复合物，由补体系统激活过程中产生的C5和C9因子结合后，再与S蛋白(玻璃体结合蛋白)结合而形成。Bb因子为补体B因子水解后的片段，为补体系统旁路激活途径的产物，而C4d因子为C4水解产物，是补体经典激活途径的产物。通过测定血清中SC5b-9、Bb因子、C4d，可直观反映C5因子的裂解和清除过程，并且反映补体系统激活情况。

4.2.2 诱导肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒在类过敏反应中最常见的原因是体内药物刺激肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒产生过敏性介质，如组胺、β-氨基己糖苷酶、类胰蛋白酶等。组胺、β-氨基己糖苷酶等过敏性介质为预先在体内合成的，贮存在分泌性颗粒中；而白三烯、血小板活化因子、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8等多种细胞因子为新合成的介质。

组胺被释放时，可与不同部位的受体相结合，引起血管通透性增加、平滑肌收缩和分泌黏液增多等过敏样症状。类胰蛋白酶具有增加血管通透性、诱发细胞因子释放、促进炎症发生等功能。嗜碱性粒细胞的主要生物学功能为参与固有免疫应答，在脂多糖或C3a、C5a作用下，可释放胞内活性介质，包括促炎细胞因子IL-4、IL-6、TNF-α等，发挥趋化、致炎等反应。李振虎等[31]通过在RBL-2H3细胞模型上测定β-氨基己糖苷酶实验，证实聚山梨酯80能够显著增加β-氨基己糖苷酶释放，表明聚山梨酯80能够促进过敏性介质的释放，也表明类过敏反应可能发生机制是通过提高细胞膜流动性、促进细胞脱颗粒释放过敏性介质引起[32]。有研究也证实QKLI诱导的RBL-2H3细胞类过敏反应可能是基于细胞膜流动性的变化，进而通过PI3K-Rac1细胞运动信号转导途径诱导了细胞骨架的变化，而敲除Rac1则减轻了PI3K的活性和细胞骨架流动性[33]。