黄酮醇化合物对自噬的作用研究进展

易 奔，张春泽，张庆怀

自噬（Autophagy）是一种高度保守的细胞降解过程，其在缺氧、氧化应激和饥饿等应激条件下被激活，自噬能够增强细胞存活能力,但在特殊条件下也能导致细胞死亡[1]。细胞死亡作为一种稳态机制发生在生理和病理条件下，当其用以调节异常状态或平衡细胞的内部环境时，这种情况下的细胞死亡称为调节细胞死亡（RCD），自噬是参与RCD的重要机制之一，阐明RCD确切的机制和信号通路，研究某些药物对RCD的影响，将有希望开发治疗神经退行性疾病[2]、癌症[3]等的特殊药物。黄酮醇化合物是一类天然的药物，山奈酚、槲皮素、高良姜素、桑色素、杨梅素是常见的几种黄酮醇化合物，能够靶向自噬发挥治疗作用。本文的目的是介绍这几种常见黄酮醇类化合物对自噬的作用机制。

1 自噬的分子机制

自噬是在各种细胞应激条件下诱导的高度保守的分解代谢过程，它能防止细胞损伤并在能量或营养缺乏的情况下促进细胞存活，并对各种细胞毒性损伤做出反应[4]，自噬过程涉及4个主要步骤，即起始/成核、延伸、成熟和降解。

自噬过程与自噬相关基因（ATGs）和AMP激活蛋白激酶（AMPK）的密切相关。哺乳动物雷帕霉素（mTOR）被认为是控制细胞自噬的中心分子，当细胞内发生饥饿、缺氧、氧化应激、蛋白质聚集、内质网应激等情况时[4]，mTOR活性被抑制，其对ULK1激酶复合体的抑制解除，自噬启动[5]。AMPK在自噬发生的调控中也发挥重要作用，在某些情况下，AMPK可以通过磷酸化ULK1直接激活ULK1[6]，诱导自噬的起始。Beclin-1是参与自噬进展的关键蛋白之一，在自噬的成核步骤中，ULK1复合物磷酸化并激活Beclin-1-VPS34（vacuolar protein sorting 34）复合物。在成熟步骤中，ATG7和ATG3将LC3（ATG8）缀合至PE（脂质磷脂酰乙醇胺）。ATG5-ATG12共轭物与ATG16L1形成复合物通过WIPI-2b锚定在新的自噬体膜的VPS34产生的PI3P上。而LC3-Ⅰ向具有膜结合能力的LC3-Ⅱ转化，随着酯化形式的LC3-Ⅱ分子不断整合到自噬前体的双层膜上，新生的自噬体膜得以扩展延伸，自噬体逐渐成熟[7]。货物的最终降解涉及与溶酶体的融合，并严格依赖于p62（SQSTM1）蛋白，这是有效自噬通量的可靠标志物[8]。

2 自噬的功能

自噬对于在病理和生理条件下维持体内稳态至关重要。一方面，自噬可以应对如营养匮乏、生长因子耗竭和低氧或缺氧等代谢应激，能清除有缺陷的蛋白质或细胞器，防止异常蛋白积聚并清除细胞内的病原体；另一方面，自噬的过度活跃则会形成自噬应激，损伤细胞器，促进自噬性细胞死亡[9]。自噬异常与组织器官发育、个体衰老、炎症、细胞免疫、肿瘤[10]和神经退行性疾病[11]等的发生密切相关。研究表明，自噬是肿瘤起始和恶性转化期间的肿瘤抑制机制，其通过去除受损的细胞和细胞器来发挥对癌症的抑制作用，从而限制了细胞的增殖和基因组的不稳定性。但是相反，自噬对癌细胞也可能起着保护作用，也就是通常所说的“保护性自噬”，高度新兴的癌细胞需要细胞构件来代谢和产生能量，而在癌症发展的这个阶段，自噬提供所有必需的细胞中间体，以满足致癌细胞增殖的代谢需求[12]。在肿瘤发展后期，自噬还能增强肿瘤细胞对化疗、放疗或其他疗法的耐受性。这表明自噬在癌症发展的不同阶段发挥的作用可能不同。

3 黄酮醇化合物及其自噬调节特性

黄酮类化合物是母核结构为2-苯基色原酮（2-phenylchromone）的多酚类化合物，多以糖苷形式存在，作为二级代谢产物广泛分布于各种植物中[13]。山奈酚、槲皮素、高良姜素、桑色素、杨梅素等都属于黄酮醇化合物，羟基在芳香环上的位置跟数量决定了这些化合物之间的差异，它们具有多种药理活性，如抗炎、神经保护、抗癌、心脏保护等[14]。因此，黄酮醇化合物对自噬的调节作用可能与黄酮醇的化学结构有关。

3.1 山奈酚 山奈酚（3，5，7，4'-四羟基黄酮）是一种黄色的黄酮醇化合物，存在于茶、卷心菜、西兰花[15]等蔬菜水果以及传统药用植物中。山奈酚因其多种生物和治疗活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、心脏保护、神经保护作用等[16]，在医学中被广泛使用。关于山奈酚的自噬调节作用进行了许多研究，Kim等[17]用山奈酚处理胃癌细胞后，癌细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG-5的表达增加，p62水平降低，提示细胞自噬增加，其诱导胃癌细胞自噬性死亡的主要途径包括AMPK-ULK1通路及与内质网应激有关IRE1-JNK-CHOP通路。EL-kott等[3]研究发现，山奈酚可通过触发内质网应激介导细胞毒性自噬，在山奈酚处理的A2780卵巢癌细胞中，LC3-Ⅰ蛋白水平显著降低，LC3-Ⅱ、ATG5和beclin 1的蛋白水平显著增加，同时癌细胞增殖受到抑制，且癌细胞死亡增加。miR-340被广泛报道为胃癌和胶质母细胞瘤等的抑癌因子，Han等[18]发现，在肺癌A549细胞内，山奈酚上调了miR-340的表达，并通过促进ATG7，LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达，抑制p62的表达，促进了细胞自噬，达到了抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞死亡的作用。山奈酚还能通过调节自噬发挥细胞保护作用，在Varshney等[19]的研究中，山奈酚通过诱导AMPK/mTOR途径介导的自噬，减轻棕榈酸诱导的脂质储存、内质网应激和胰岛β细胞功能障碍，其可能成为预防肥胖相关糖尿病并发症的潜在候选治疗药物。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）已被报道可诱导内皮细胞（ECs）凋亡并促进动脉粥样硬化，山奈酚通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路上调人内皮细胞自噬，减轻ox-LDL诱导的细胞凋亡，具有抗动脉粥样硬化的作用[20]。

3.2 槲皮素 槲皮素（3，3'，4'，5，7-五羟基黄酮）是类黄酮类（黄酮醇亚类）的一种多酚化合物，广泛存在于羽衣甘蓝、洋葱、还有各种水果中[21]，具有抗糖尿病、抗肿瘤、保肝、肾保护、神经保护等作用[22]。有关槲皮素对SMMC7721肝癌细胞的作用体内外研究表明，槲皮素以剂量和时间依赖的方式显著上调肝癌细胞中LC3A/B-Ⅱ和beclin1的蛋白水平，下调p62蛋白水平，通过抑制AKT/mTOR信号通路和激活MAPK通路促进自噬，其显著抑制了与凋亡诱导和自噬刺激相关的肿瘤生长[23]。槲皮素能够刺激人白血病HL-60细胞的凋亡和自噬，但是值得注意的是，其诱导的自噬对HL-60细胞具有保护作用，而抑制自噬可以促进槲皮素诱导的HL-60细胞凋亡[24]。Taylor等[25]研究发现，槲皮素可以抑制胶质母细胞瘤细胞的保护性自噬，在营养缺乏的条件下诱导胶质母细胞瘤细胞自噬以后，槲皮素和丁酸钠的给药导致Beclin-1和LC3II水平降低，提示自噬被抑制。这种组合导致凋亡癌细胞数量增加。为了探究槲皮素对肝纤维化的影响，Wu等[26]进行了研究，在BDL和四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中，槲皮素降低了Beclin-1和LC3的表达，增加了P62的表达。槲皮素通过抑制TGF-β1/Smads信号通路和激活PI3K/Akt信号通路抑制自噬来减轻肝损害。为了研究槲皮素对氧化损伤内皮祖细胞的潜在保护作用，Zhi等[27]进行了研究，体外实验结果表明槲皮素通过激活ERK信号通路促进内皮祖细胞的自噬，并以剂量依赖的方式减少了ox-LDL（氧化低密度脂蛋白）引起的内皮祖细胞凋亡，还改善了ox-LDL处理的内皮祖细胞中的管形成、迁移和粘附，将细胞功能恢复到与非ox-LDL处理的细胞相似的水平，这种保护作用是通过诱导自噬来实现的。

3.3 高良姜素 高良姜素（GA，3，5，7-三羟基黄酮）是天然活性黄酮醇化合物之一，是一种多酚类化合物，主要从高良姜、松柏、车前草和半枝莲的根中提取。高良姜素素具有许多生物活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、细胞保护等作用[28]。在Zhang等[29]的研究中，高良姜素通过激活AMPK和抑制HepG2细胞中mTOR的活性来诱导自噬，抑制HepG2细胞的增殖。自噬泡的形成和LC3-Ⅱ蛋白的表达证实了高良姜素对自噬的诱导作用。不同的是，Kong等[30]研究表明，高良姜素同时诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡、细胞焦亡和保护性自噬，高良姜素通过激活胶质母细胞瘤细胞中的AMPK/mTOR途径诱导保护性自噬，抑制自噬加重了高良姜素诱导的胶质母细胞瘤细胞凋亡和焦脱。冈田酸（OA）诱导的神经毒性可能被认为是研究阿尔茨海默病（AD）病理学的新工具，Huang等[31]研究发现，OA可以激活PC12细胞自噬并增加Beclin-1的表达，相反，高良姜素显著降低Beclin-1的表达，促进Akt和mTOR磷酸化，但抑制GSK3β磷酸化，起到抑制自噬的作用。Xuan等[32]使用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎样模型研究了高良姜素给药对肠道炎症的潜在影响，与对照组相比，在结肠炎小鼠中观察到自噬标记蛋白（包括ATG5、ATG7、ATG12和LC3B）下调。而高良姜素通过增加上述自噬相关蛋白促进结肠细胞自噬，减轻了肠道炎症引起的损伤，以及临床绞痛症状。Zhang等[33]用高良姜素治疗增加了HFD小鼠和非酒精性脂肪肝细胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Atg3、AMPKα1和磷酸化AMPKα1蛋白的表达水平，并降低了mTOR的表达。高良姜素在体内外诱导自噬改善肝细胞脂肪变性，具有肝脏保护作用。

3.4 桑色素 桑色素（2'，3，4'，5，7-五羟基黄酮）是一种生物活性化合物，尤其在桑科植物中含量丰富。桑色素已被证明具有多种药理活性，包括减轻炎症、心脏保护、抗癌活性、免疫调节、抗菌活性等[34]。Singh等[35]研究发现，桑色素能减轻顺铂诱导的HEK-293人胚胎肾上皮细胞炎症和自噬，桑色素和顺铂联合治疗能显著抑制p-AMPK、BECN-1和LC3II的表达水平从而抑制内质网应激介导的自噬和细胞死亡机制，其有望成为在顺铂化疗期间的肾脏保护剂。无烟烟草提取物（STE）通过降低人类鳞状上皮细胞SCC-25的活力，同时诱导凋亡和自噬信号，参与口服毒性。体外研究发现[36]，一定剂量的桑色素能够抑制STE处理的人类鳞状上皮细胞SCC-25细胞中活性氧诱导的自噬，消除STE诱导的细胞毒性，发挥细胞保护作用。创伤性脑损伤（TBI）与影响认知、记忆和行为的神经退行性病变密切相关。研究发现[37]，桑色素能抑制创伤性脑损伤小鼠模型的痴呆标志物，降低炎症标志物和调节凋亡/抗凋亡参数，增强自噬过程（LC3BⅡ，Beclin-1水平升高），发挥神经保护作用。Zhang等[38]发现桑色素处理显著上调了人脐静脉内皮细胞LC3的表达，下调了p62的表达，通过激活AMPK信号通路诱导自噬减轻氧化型低密度脂蛋白介导的损伤，发挥血管保护作用。

3.5 杨梅素 杨梅素（3，5，7，3'，4'，5'-六羟基黄酮醇）最初是从杨梅树皮中分离得到的，它是一种由淡黄色晶体组成的多羟基黄酮醇化合物，常见于水果、蔬菜等日常食品中。现代药理学研究表明，杨梅素具有多种生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和和保护肝脏免受潜在损伤等[39]。关于杨梅素对自噬的作用的研究较少，Cao等[40]研究发现，用杨梅素处理增加了肝癌细胞LC3-Ⅱ和PI3KⅢ的水平，下调了P62的水平，并通过抑制mTOR磷酸化诱导HepG2细胞自噬，虽然使用杨梅素抑制了肝癌细胞的增殖，但是研究发现杨梅素诱导的自噬对肝癌细胞具有保护作用，而抑制自噬增加了肝癌细胞的凋亡。Kim等[41]和Nirmala等[42]证明杨梅素可以在体外和体内抑制结直肠癌的生长。Zhu等[43]研究了杨梅素对诱导结肠癌细胞凋亡和自噬的影响，结果表明，杨梅素处理后，HCT116和SW620结肠癌细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1的水平升高，杨梅素通过抑制HCT116和SW620细胞的PI3K/Akt/mTOR信号诱导保护性自噬，而抑制杨梅素诱导的自噬可以增强杨梅素诱导的人结肠癌细胞HCT116和SW620细胞凋亡。M10是杨梅素的一种衍生物，是在杨梅素的基础上加入亲水基团设计的。这种化学改性可以提高M10的溶解度，提高其生物活性，扩大其应用范围。研究发现，M10可以显著抑制自噬体、LC3-Ⅱ和Bcelin-1的形成，从而抑制内质网应激介导的自噬，抑制结直肠肿瘤的发生[44]。

4 其他黄酮醇化合物对自噬的影响

上文介绍了对自噬具有调节作用的五种黄酮醇化合物，除此之外，其他黄酮醇，如芦丁和非瑟桐等，也具有调节自噬的作用，低浓度芦丁（3，3'，4'，5，7-五羟基黄酮-3-鼠李糖苷）治疗可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制自噬减轻吡柔比星对心肌细胞的心脏毒性作用[45]，芦丁还通过抑制自噬增加替莫唑胺对胶质母细胞瘤的细胞毒性[46]，非瑟桐（3，7，3'，4'-四羟基黄酮）不仅能抑制人类非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中的mTOR信号通路通路，还能抑制上游激酶PI3K/Akt信号通路，对mTOR和PI3K/Akt的抑制均抑制癌细胞的存活和生长[47]。

5 结语

自噬是一种细胞存活机制，对于在生理和病理条件下保持体内平衡至关重要，自噬异常与多种疾病的发生发展有关。在过去的几十年里，天然化合物作为潜在的抗癌药物获得了许多关注，其具有丰富的药理活性且比化疗更安全。山奈酚、槲皮素、高良姜素、桑色素、杨梅素这几种黄酮醇化合物通过影响 LC3-Ⅱ、ATG、p62和Beclin-1，P53等分子水平来下调或上调自噬，PI3K/Akt/mTOR/AMPK是常见的自噬调节通路。虽然许多黄酮醇化合物的体外功效已经有了研究，但大多数化合物对自噬的作用缺乏有效的体内证据以及临床研究，研究人员在将这些天然化合物用作临床环境中的治疗之前仍面临挑战。此外，黄酮醇化合物的低生物利用度限制了其临床应用，已有一些方法来提高其利用度，如使用吸收促进剂、结构转换（如前药、糖基化）和制药技术（如载体复合物、纳米技术、共晶）[48]等，但这些技术仍存在缺点，因此需要更多的研究来改善。