活动性肺结核免疫学检测技术应用现状及展望

刘辉敏 田瑶 贝承丽 傅满姣

终止全球结核病流行的关键在于控制传染源、切断传播途径。研发高敏感度和高特异度的检测技术及试剂以对活动性肺结核进行早诊断、早治疗，对降低结核病的发病率极为重要。病原学阳性是诊断活动性肺结核的金标准[1]。痰抗酸杆菌涂片简单、有效，但痰标本的质量难以保证、阳性率低，且无法有效区分结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)与非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)[2]。MTB培养可有效提高病原学阳性率，但周期长，易延误诊治[3]。分子生物学检测可有效提高活动性肺结核患者痰液病原学的检出率，临床应用广泛[4]。通过基于气管镜的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)联合分子生物学检测、肺组织活检，以及超声内镜引导下的经支气管针吸活检(endobronchial ultrasound-transbronchial needle aspitation，EBUS-TBNA)等检测技术获取深部组织和分泌物亦可有效提高检出率[5]，但费用昂贵且为有创操作，大部分患者难以接受。

为提高活动性肺结核诊断的准确率，寻找病原学依据极为重要，但我国存在大量病原学阴性(抗酸染色、核酸检测、培养等方法无法检出MTB)的活动性肺结核患者，缺乏便捷、准确的检测技术及明确的诊断标准，使得该类患者难以确诊[6]。我国《肺结核活动性判断规范及临床应用专家共识》指出，对于病原学阴性的肺结核活动性判定，应从以下方面综合考虑：咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、乏力、盗汗、发热、食欲减退等临床表现；提示活动性结核病的典型肺部影像学表现；免疫学检测中结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)和γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assay，IGRA)阳性提示结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)也具有一定的参考价值[7]。我国《WS 288—2017 肺结核诊断》标准提出：排除肺部其他疾病后，免疫学检查中TST中度阳性或强阳性、IGRA阳性、MTB抗体阳性3项中满足任意一项，以及具有典型肺部结核病影像学表现，即可临床诊断为结核病[1]。对于病原学依据不足的活动性肺结核患者，免疫学检测具有取材方便、价格低廉、快速、敏感的优势，具有非常重要的临床应用价值，应用前景广泛。

一、细胞免疫与细胞因子检测

1.TST：TST将结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)注射到受试者体内，通过人体的免疫反应，观察其是否出现迟发型超敏反应，以判断是否感染过MTB[8]。我国人群普遍接种了卡介苗(bacille Calmette-Guérin，BCG)。PPD与BCG和NTM之间存在交叉反应，检测特异度较低，假阳性率高；对免疫受损人群的检测敏感度不足；并且，其结果通过人为观察得到，主观性强。因此，TST阳性结果仅能提示MTB感染，对于临床判断活动性肺结核意义不大[9]。

2.IGRA：IGRA是一种以细胞免疫反应为基础的免疫学诊断方法，临床应用较广泛。MTB基因组学的发展促进了此检测方法的发展。BCG菌株及大多数非致病性分枝杆菌基因组中均缺乏MTB的RD1区；RD1区仅存在于结核分枝杆菌复合群及少数致病性分枝杆菌基因组中。MTB的RD1区上Rv3874编码的培养滤液蛋白10(culture filtrate protein-10，CFP-10)和早期分泌抗原靶蛋白6(early secreting antigen target-6，ESAT-6)是MTB的RD1区基因片段编码的两种主要抗原[10-11]，与机体内Th1细胞结合，可引起强烈的、特异性的T细胞反应，导致T细胞分泌大量γ-干扰素(IFN-γ)。基于该原理开展的结核感染T细胞斑点试验(T-cell spot of tuberculosis，T-SPOT.TB)，对MTB抗原敏感的效应T细胞进行定量检测，具有较高的敏感度和特异度，但检测结果阳性仅表示体内存在针对MTB的效应T细胞，无法有效鉴别活动性肺结核与LTBI[12-14]。国内研究显示，IGRA检测活动性结核病的敏感度为53%～98%，特异度为60%～90% (或以上)，差异较大[15]。但多数报道中IGRA检测的敏感度和特异度均超过70%；在病原学阴性的活动性结核病中，IGRA检测的总体敏感度为80%，总体特异度为79%，均高于TST，可作为缺乏病原学依据的肺结核活动性判断的辅助手段[16-17]。

王婷等[18]发现T-SPOT.TB结果阳性对诊断活动性结核病的敏感度为91.0%，特异度为75.2%。Wang等[19]对T-SPOT.TB结果进行深度分析，发现结核特异性抗原(TB-specific antigen，TBAg)与植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)斑点数的比值可有效诊断活动性结核病和LTBI，以0.234为临界值时，其敏感度为69.5%，特异度为94.1%，受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)为0.881，效果优于T-SPOT.TB；以0.236为临界值时，TBAg/PHA比值鉴别结核球与孤立性肺结节或肿瘤的敏感度为80.6%，特异度为93.3%，AUC为0.921；以0.129为临界值时，TBAg/PHA比值对鉴别结核球和其他良性疾病的敏感度为85.1%，特异度为90.0%，AUC为0.909。此外，该比值对肺外结核亦有一定的诊断价值，同时该比值在抗结核治疗中出现明显下降，提示该指标在有效区分活动性结核病与LTBI的同时能对抗结核治疗疗效进行监测[20-21]。Luo等[22]对T-SPOT.TB检测结果中ESAT-6斑点形成细胞平均斑点大小联合改良TBAg/PHA比值鉴别活动性结核病和LTBI进行研究，活动性结核病患者ESAT-6斑点形成细胞平均斑点大小和改良TBAg/PHA比值均明显高于LTBI者，建立二者的联合诊断模型，以0.46为临界值时，该模型鉴别活动性结核病和LTBI的AUC值高达0.959，敏感度为90.12%，特异度为91.02%。

3.细胞因子检测：结核病患者体内免疫机制以细胞免疫为主，对于控制、杀灭MTB，巨噬细胞发挥了重要作用。巨噬细胞吞噬MTB后，产生白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和转化生长因子(TGF)-β等一系列的细胞因子，各细胞因子又可反向调节巨噬细胞抗菌活性。目前认为，Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-12 等)促进免疫应答；Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)抑制免疫应答。血浆中一些特异性的细胞因子和趋化因子能够作为诊断活动性结核病的免疫学标志物，多种细胞因子的组合可以区分机体内MTB的不同感染状态。

IFN-γ是其中最关键的细胞因子，目前临床上应用广泛。对于活动性结核病患者，结核病初诊时及抗结核治疗期间和治疗后的IFN-γ水平的变化存在争议。有研究认为无明显差异，也有研究显示可出现下降或阴转，亦有部分患者呈现持续上升的趋势[23-25]。随着IL-2、单核细胞趋化蛋白2(MCP-2)、干扰素诱导蛋白10(IP-10)等细胞因子的发现，一些IFN-γ水平较低、T-SPOT.TB阴性的活动性结核病患者得到早期诊断和治疗[26]。一项Meta分析表明，IP-10诊断活动性结核病的AUC为0.88，诊断LTBI的敏感度和特异度分别为73%和83%[27]。Luo等[28]发现使用嗜酸粒细胞激活趋化因子、CCL22和MCP-1等3种细胞因子的组合能有效区分活动性结核病和LTBI，其敏感度为87.76%，特异度为91.84%，AUC为0.94。IFN-γ和IL-2分泌量与结核病的临床疾病状态有关，活动性肺结核患者T细胞以分泌IFN-γ和IL-2为主，IL-2可作为鉴别活动性结核病和LTBI的潜在生物标志物。余艳艳等[29]对381份临床样本(256例结核病患者、69例非结核病患者、56名健康人群)进行研究，其中结核病组排除陈旧性肺结核及LTBI者，发现IFN-γ和IL-2双因子联合检测在活动性结核病诊断中的双阳敏感度为75.12%，特异度为94%，可有效提高结核病的检出率。随着技术不断进步，未来研究应关注多种细胞因子联合检测，以提高诊断的准确率。这可能是鉴别活动性肺结核和LTBI及判断结核病治疗疗效的关键。

二、体液免疫检测

体液免疫检测技术是诊断结核病的重要方法，临床应用较为普遍。多采用受试者血清标本进行检测，通过酶联免疫法、免疫胶体金渗滤法等来检测受试者血清中的抗原、抗体、细胞因子水平，具有简单、高效、便捷等优点。但其检测的敏感度和特异度则会根据检测方法及抗原抗体的变化而改变。

1.MTB抗原检测：利用抗原抗体反应测定人体内抗原浓度判断机体是否感染MTB。目前的MTB抗原有：PPD、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)、ESAT-6、CFP-10、抗原85(Ag85)复合物、38 kD抗原、31 kD抗原等。当人体感染MTB后，抗原刺激机体产生抗体需要经过一段时间，因此抗原检测具有早期诊断意义。

LAM是构成分枝杆菌细胞壁中脂多糖的主要部分，具有高免疫原性，可在尿液标本中被检出，具有高效、便捷、低廉、无创、简单、可床旁开展等优点[30-31]。对其检测具有较髙的准确度，可用于诊断CD4+T淋巴细胞<100个/μl或重症HIV患者是否并发结核病。有研究评估痰液LAM检测作为抗结核疗效监测的指标，亦有一定的优势[32-33]。Rv3873、Rv3615c是MTB感染进展为活动性结核病的早期标志物。孙卫国等[34]发现Rv2660c只能与活动性结核病(包括病原学阳性和阴性)患者血清发生抗原抗体反应，出现一条明显的杂交条带；LTBI者和健康对照者血清则无该条带出现。刘永亮[35]发现Rv0183能够刺激全血分泌IL-6，并且在活动性结核病患者中的表达水平明显高于LTBI人群和健康人群。唐洁等[36]利用Mtb-HAg-10k特异性诱导人外周血单个核细胞(PBMC)产生TNF-α和IFN-γ，发现活动性结核病患者PBMC中IFN-γ产生细胞数明显低于LTBI者，可有助于区分活动性结核病和LTBI。

某些抗原在MTB休眠状态下特异性表达，如DosR蛋白抗原。Shi等[37]从25个DosR蛋白抗原中筛选出一组包含9个DosR蛋白抗原的组合，为HspX(Rv2031c)、Hrp1(Rv2626c)、DevR(Rv3133c)、Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2628、Rv3129和Rv3131，该组合预测活动性结核病的敏感度为10/10，预测LTBI的敏感度为9/10，特异度均为100%(14/14)，整体检测正确率为97.1%。

MTB抗原检测可避免因机体免疫应答低下导致的假阴性，作为MTB存在的直接证据，对诊断活动性肺结核具有重要价值。但MTB抗原种类及数目繁多，如何合理选择抗原来诊断活动性肺结核目前尚无定论。单一抗原进行诊断的效果欠佳，多种抗原的联合检测及相关抗原蛋白的融合表达为今后MTB抗原诊断的发展提供了新思路。

2.MTB抗体检测：利用抗原抗体反应测定人体内抗体滴度判断机体是否感染MTB。MTB抗体检测对活动性结核病的诊断具有一定的价值，特别是对痰涂片/痰培养阴性、少/无痰及肺外结核者[38]。但人体血液中抗体为多克隆抗体，MTB抗原检测时易出现交叉反应，准确性偏低；重症结核病、HIV感染等免疫力低下者体内的MTB抗原难以刺激机体产生足量的抗体，致使敏感度较低，存在假阴性可能；初愈结核病患者体内MTB抗体浓度较高，存在假阳性。活动性肺结核患者体液中MTB抗体水平较高，随着治疗进展，MTB抗体水平降低，抗体检测对结核病患者疗效判断有一定价值。

三、新技术与思路

以免疫学检测为基础的蛋白芯片技术是将不同的蛋白质分子按预先设置的排列顺序有序地固定在载体表面做成微阵列检测芯片，用标记了特定荧光物质的抗原或抗体与其反应，利用荧光扫描仪等检测芯片上各点的荧光强度，再对各样本中的蛋白进行分析。其具有所需样本量少、高通量、高敏感度、方便、快速等优点[39]。Cao等[40]采用含有4262种抗原的蛋白质芯片筛选可鉴别LTBI与活动性结核病患者的血清生物标志物，ROC分析显示，Rv2031c、Rv1408、Rv2421c等3种抗原的AUC分别为0.8520、0.8152、0.7970。蛋白芯片技术是近年来新兴的一种方法，也存在无法区分既往感染及现症感染的不足，对活动性肺结核的诊断意义有必要进一步研究。

MTB入侵宿主体内，宿主为抵抗会启动一系列免疫应答反应，称为结核宿主反应。利用转录组学的方法获取活动性结核病患者全血细胞转录组图谱，筛选出可用于诊断活动性结核病的多个基因标志物，是诊断活动性肺结核的突破点[41]。Warsinske等[42]将Sweeney团队筛选出的在活动性结核病患者中表达水平与其他患者明显不同的3个基因(GBP5、DUSP3、KLF3)整合，创建了一个3-基因结核分数(3-gene TB score)，可有效鉴别活动性结核病与LTBI。将来基于转化医学的新型宿主免疫学诊断标志物的寻找也是鉴别肺结核活动性的关键，为结核病免疫学诊断提供了新的思路。

四、总结

目前，对病原学阴性活动性肺结核的诊断仍是临床诊疗中的热点及难点问题。对于痰液病原学阴性的患者，推荐使用支气管镜下肺泡灌洗、肺活检等手段获取病理学和病原学依据，如仍无法明确，则需通过临床症状、影像学、免疫学、诊断性抗结核治疗综合判断。

对于肺结核活动性的判断仍有许多问题需要解决，包括研究高敏感度和特异度的检测手段，发掘高效准确的生物标志物，建立科学的诊断流程。多种抗原及细胞因子联合检测，对于判断肺结核活动性有一定的价值，结核宿主免疫反应相互作用机制的深入研究也为临床诊断活动性肺结核提供了新方法。但目前仍缺乏统一的标准，结合新技术新方法，多种标志物联合诊断提高对活动性肺结核诊断的敏感度和特异度是当前诊断方法发展的趋势，可能是未来鉴别肺结核活动性和LTBI，以及预测结核病发病风险，解决结核病患者精准治疗和精准停药等临床问题的关键。