CaCl2对小麦粉面筋蛋白聚集特性及二级结构的影响

王小花，梁 赢，贾 峰，王 琦，王金水

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

几千年来，以小麦为基础的面制食品一直是亚洲国家人们饮食的重要组成部分[1]。在面制品(面条、馒头和面包)生产加工中，通常用食盐作为改良剂，不仅能赋予面制品独特的风味和色泽，还能提高其功能特性[2]，但摄入过量会增加患高血压和心血管等慢性疾病的风险[3-4]。目前，许多学者探索钠盐替代品以解决此问题，作者前期研究在面团形成过程中添加NaCl、KCl和低钠盐(NaCl和KCl混合盐)，发现添加这些盐显著提高了面团的稳定性、形成时间、拉伸面积和最大拉伸阻力[5]。CaCl2在面制品加工过程中提供二价钙离子，与一价钠离子和钾离子的作用机制不同，其与水相互作用能力弱，不易被水化，能够破坏已形成的氢键[6]。不少学者在面团形成中添加CaCl2，探究其对面团流变学特性的影响。杨鹏程等[7]研究CaCl2对小麦面团拉伸特性的影响，发现添加CaCl2降低了面团的最大拉伸阻力和延伸度。Tuhumury等[8]研究不同阳离子Hofmeister系列盐对小麦粉面团混合性能的影响，结果表明，添加CaCl2的面团其吸水率和形成时间显著降低，与NaCl、KCl相比，CaCl2降低了面团的耐搅拌性能。Cao等[9]在面团制作过程中添加极低浓度的NaCl和CaCl2，研究其对小麦面团动态流变学特性的影响，结果表明，添加CaCl2的面团弹性模量高于添加NaCl的面团。

目前关于CaCl2对小麦粉及小麦面团聚集特性及结构特性的影响尚不清楚，而面筋蛋白作为小麦蛋白的主要成分，对面团行为和最终产品品质起着决定性作用。因此，作者研究了不同添加量CaCl2对小麦粉面筋蛋白聚集特性、面团质构及面筋结构特性的影响，以期为钠盐替代及改善小麦制品的加工性能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中筋粉(粗蛋白含量10.80%、水分含量13.49%、脂肪含量1.28%)：中粮面业漯河有限公司；CaCl2、NaCl：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Glycine)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素(Urea)：分析纯，索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

面筋聚集仪：德国Brabender公司；TA-XT Plus质构仪：上海瑞玢智能科技有限公司；F-7100荧光分光光度计：日本日立高新技术公司；傅里叶红外光谱仪：德国布鲁克公司；JHMZ-200和面机：郑州中谷机械设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小麦粉水分含量的测定

参照GB 5009.3—2016的方法测定小麦粉水分含量。

1.3.2 小麦粉面筋蛋白聚集特性的测定

参考Wang等[10]的方法并稍做修改。分别将CaCl2(0、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%)和NaCl(3.2%)(以面粉干基为基础)加入蒸馏水中，然后将8.5 g面粉分散在9.5 g水中，以水分含量14%为基础调整水和面粉质量，保持液固比恒定(1.12)。参数设置：温度35 ℃，转速2 700 r/min，时间300 s。评价指标：峰值最大时间(PMT)和峰值扭矩(MT)。

1.3.3 面团的制备

参考Liu等[11]使用的方法制备CaCl2添加量为0(C1)、0.2%(G1)、0.4%(G2)、0.8%(G3)、1.6%(G4)、3.2%(G5)，NaCl添加量为3.2%(N1)的面团(以面粉干基为基础)。分别将CaCl2或NaCl溶解在蒸馏水中，配制盐溶液。小麦粉(100.0 g)和盐溶液(62.5 mL)放入搅拌碗中，每个面团搅拌7 min，静置20 min。

1.3.4 面团质构特性的测定

参考Angioloni等[12]使用的方法并稍做修改。将制备好的鲜面团置于内径2 cm的圆柱形模具中，平衡5 min后放在质构仪的载物台上，进行TPA测定。参数设置：TPA模式，P-50探头，测前、测中和测后速率分别为1.0、2.0、2.0 mm/s，下压距离10.0 mm，时间10 s，触发力10.0 g。

1.3.5 面筋蛋白的提取

分别从CaCl2和NaCl制备的面团中分离和收集面筋组分，冷冻干燥(24 h)后研磨成粉末，过90目筛，于-20 ℃保存，备用。

1.3.6 面筋蛋白提取率的测定

参考Pietsch等[13]使用的方法并稍做修改。将30 mg冻干样品溶解于10 mL提取液中，提取液含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Glycine、4 mmol/L Na2EDTA、8 mol/L Urea和0.5% SDS，pH 9.1。所有样品溶于提取液后，高速振荡1 min，再室温振荡60 min(250 r/min)，最后离心20 min(17 700g)，收集上清液，用荧光分光光度计测定荧光强度。参数设置：激发波长295 nm；发射光谱300～450 nm，狭缝宽度5 nm。

1.3.7 面筋蛋白二级结构的测定

参考Skendi等[14]使用的方法并稍做修改。采用傅里叶红外光谱溴化钾压片法测定蛋白质的二级结构，将冻干面筋样品与KBr按质量比1∶ 100混合，研磨后压制成均匀透明的薄片。参数设置：400～4 000 cm-1全波段扫描，扫描信号累加32次，分辨率4 cm-1，信噪比>500。采用Peak Fit v4.12对谱图进行基线校正、高斯去卷积处理、二阶导数拟合，根据各二级结构对应的区间范围得到其含量。

1.4 数据处理

每组试验重复3次以上，结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 20.0和Origin 8.5处理数据。通过单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多范围检验进行显著性分析(P< 0.05)。

2 结果与分析

2.1 CaCl2对小麦粉面筋蛋白聚集特性的影响

面筋聚集仪基于剪切能快速评估面筋蛋白的聚集能力，面粉和CaCl2溶液混合，在外力作用下，面筋网络快速形成，面筋蛋白聚集曲线急剧升高，进一步施加外力，面筋网络会被破坏，扭矩曲线下降[15]。添加CaCl2后小麦粉面筋蛋白聚集特性曲线如图1所示，随着CaCl2添加量的增加，峰值曲线明显向左偏移，说明峰值最大时间明显缩短。Goldstein等[16]报道品质差的小麦粉其特点是稠度迅速增加，随后又迅速降低，面筋蛋白聚集时间较短；强筋面粉其稠度增加的速度相对较慢，达到峰值稠度需要较多时间。表明添加CaCl2降低了小麦粉面筋品质，甚至可能会影响网络结构的稳定性。此外，NaCl添加量3.2%的面筋蛋白聚集曲线明显向右偏移，说明峰值形成时间明显大于CaCl2添加量3.2%的，原因可能与离子的类型有关。

注：C1为CaCl2添加量0，G1—G5分别为CaCl2添加量0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%，N1为NaCl添加量 3.2%。图2—图4同。表1、表2同。图1 CaCl2不同添加量的小麦粉面筋蛋白聚集特性曲线Fig.1 Gluten aggregation characteristic curve of wheat flour with different CaCl2 additions

表1 CaCl2不同添加量对面团质构特性的影响Table 1 Effects of different CaCl2 additions on the textural properties of wheat flour dough

CaCl2不同添加量对小麦粉面筋蛋白聚集特性的影响如图2所示。峰值最大时间(PMT)是反映麦谷蛋白聚集力学的指标，最大扭矩(MT)是反映小麦粉面筋强度的指标[17]。由图2可知，与空白样品(C1)相比，CaCl2添加量为0.2%和0.4%时，PMT显著低于C1，而0.2%和0.4%CaCl2处理的样品PMT变化无显著性差异；随着CaCl2添加量的进一步增加(0.8%～3.2%)，PMT显著降低，说明添加CaCl2能加速面筋的形成，从而缩短面筋聚集时间。这种加快效应可能是由于钙离子属于“结构破坏型离子”，钙离子的引入导致水结构的无序，使水分子更快地渗透到蛋白质结构中，从而使得蛋白质更快地展开[18]；也有可能是蛋白质间通过Ca2+形成盐桥促进蛋白质快速聚集[9]。Melnyk等[19]研究发现，面筋蛋白聚集时间的变化规律遵循Hofmeister系列，其中Ca2+减少面筋蛋白聚集时间，这与本研究的结果一致。与N1相比，CaCl2添加量3.2%的样品峰值最大时间明显缩短。此外，与C1相比，添加CaCl2的样品MT增加，且随着CaCl2添加量增加，MT显著增加。峰值扭矩可能与有效参与蛋白的聚集量有关，且有助于在面筋展开完成后形成充分的面筋结构[19]；峰值扭矩也可能是由各种相互作用的叠加决定的，而盐桥在其中只占很小的比例[9]。因此，CaCl2添加量如何影响面筋蛋白的峰值扭矩还需要进一步的研究认证。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图3同。图2 CaCl2不同添加量对小麦粉面筋蛋白聚集特性的影响Fig.2 Effects of different CaCl2 additions on gluten aggregation characteristics of wheat flour

2.2 CaCl2对面团质构特性的影响

CaCl2不同添加量对面团质构特性的影响见表1，与C1相比，添加CaCl2降低了面团的硬度、弹性、咀嚼性、内聚性和回复性，表明CaCl2可能阻碍面团内部面筋网络的形成，进而导致面团品质的下降。其中面团的硬度、弹性和咀嚼性随CaCl2添加量的增加而显著降低，回复性随CaCl2添加量的增加变化不显著，这与杨鹏程[20]的研究结果一致。面团的黏附性随CaCl2添加量的增加先显著增加再降低之后趋于平缓。另外，面团的弹性和内聚性跟面筋网络结构的交联点多少呈高度正相关[20]。本研究中面团的弹性和内聚性降低，表明添加CaCl2使面筋网络结构的交联点减少，进而减弱蛋白质分子间的相互作用，从而进一步证实前面所述的面团品质变差的结果。添加3.2% CaCl2的面团与添加3.2% NaCl的面团相比，其硬度、弹性、黏附性和咀嚼性有显著性差异，内聚性和回复性变化不大。

2.3 CaCl2对面团面筋蛋白提取率的影响

面筋蛋白在含变性溶剂中的可提取性是测定小麦面筋蛋白亚基间聚合反应的常用方法，提取溶剂的荧光强度反映小麦面筋蛋白聚合的程度，即提取溶剂的荧光强度越大，小麦面筋蛋白的可提取率越高，小麦面筋蛋白聚合程度越小[21]。由图3可知，CaCl2在低添加量(0.2%和0.4%)时，面筋蛋白的荧光强度降低，表明面筋蛋白的可提取率降低，面筋蛋白发生了一定程度的聚合，这与杨鹏程[20]的研究结果一致。原因可能与静电自由能的变化有关，也可能是由Ca2+交联了带负电荷的羧基(—COOH)导致。随着CaCl2添加量的进一步增加(0.8%～3.2%)，面筋蛋白的荧光强度变化不显著，原因可能是CaCl2添加量较高时，会出现盐析效应，导致蛋白质内部疏水性基团完全暴露至疏水基团达到极点，因此面筋蛋白的提取率没有显著变化[18]。另外，CaCl2添加量3.2%的面筋蛋白提取率高于NaCl添加量 3.2%的，表明添加NaCl的样品其聚集程度大于添加CaCl2的样品。

图3 CaCl2不同添加量对面团面筋蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of CaCl2 on the extractability of gluten isolated from wheat dough

图4 面筋蛋白的傅里叶红外光谱特征曲线Fig.4 Characteristic curve of gluten Fourier infrared spectra

2.4 CaCl2对面筋蛋白二级结构的影响

图4为面筋蛋白的傅里叶红外光谱图。酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)对蛋白质二级结构变化较敏感，吸收强度较大[22]，其中酰胺Ⅰ带在1 614～1 640 cm-1和1 670～1 690 cm-1为β-折叠结构的特征吸收，1 640～1 650 cm-1为无规则卷曲结构的特征吸收，1 650～1 660 cm-1为α-螺旋结构的特征吸收，1 660～1 670 cm-1和1 690～1 700 cm-1为β-转角结构的特征吸收[23]。由图4可知，CaCl2不同添加量的面筋蛋白其FTIR谱图的出峰位置和走势基本一致，说明添加CaCl2不能改变面筋蛋白的特定基团，而是改变面筋蛋白二级结构的含量，与杨鹏程[20]的研究结果一致。

表2为CaCl2对面筋蛋白二级结构酰胺Ⅰ带的拟合结果，β-折叠是面筋蛋白二级结构的主要结构，与桂俊等[24]研究结果一致。由表2可知，与空白样品相比，不同添加量的CaCl2显著降低面筋蛋白的β-折叠含量，提高无规则卷曲和β-转角含量，α-螺旋含量无显著性变化。表明添加CaCl2的面筋蛋白其构象变化主要取决于β-折叠、无规则卷曲和β-转角含量，进而影响面筋网络结构。Choi等[25]研究表明，α-螺旋和β-折叠结构是比较有序的结构，具有较高的稳定性；β-转角和无规卷曲是无序结构。本研究中添加CaCl2导致面筋蛋白的无规则卷曲和β-转角含量增加，而β-折叠含量降低，使面筋网状结构变得不稳定。面筋结构的稳定性变差，可能是面团硬度、内聚性和弹性降低的主因。另外，NaCl添加量3.2%的样品二级结构含量的变化与添加CaCl2的面团有显著性差异，主要体现在β-折叠含量增加、β-转角含量降低、无规则卷曲和α-螺旋含量无显著性变化(与空白相比)。CaCl2和NaCl对蛋白二级结构差异的原因可能是由于添加CaCl2引入二价阳离子破坏了氢键的形成，从而使得面筋蛋白的二级结构变得无序，最终可能导致面团的质构性能发生改变。

表2 CaCl2不同添加量对面团面筋蛋白二级结构的影响Table 2 Effect of CaCl2 on secondary structure of gluten in dough

3 结论

小麦粉面筋蛋白聚集特性的结果表明，随着CaCl2添加量的增加，PMT显著降低，说明CaCl2加快面筋的形成，缩短面筋聚集时间；面团质构特性的结果表明，添加CaCl2降低面团的硬度、弹性、咀嚼性、内聚性和回复性，且硬度、弹性和咀嚼性随CaCl2添加量的增加而显著降低，回复性随CaCl2添加量的增加变化不显著，黏附性随CaCl2添加量的增加先显著增加再降低之后趋于平缓，说明CaCl2可能阻碍面团内部面筋网络的形成，进而使面团品质特性变差；面筋蛋白二级结构的结果表明，添加CaCl2增加无规则卷曲和β-转角含量，降低β-折叠含量，α-螺旋含量无显著性变化，说明面筋蛋白的二级结构变得无序，面筋网状结构的稳定性变差。以往的研究大多只简单地研究CaCl2对面团流变学特性的影响，而对CaCl2在面团加工中的研究较少，本研究利用面筋聚集仪分析面筋蛋白的聚集特性，并从面筋结构变化的角度探讨CaCl2对面筋蛋白聚集特性的影响。研究结果表明CaCl2影响了面团面筋的品质，为面制品加工业及减钠策略提供理论基础。