拟穴青蟹不同卵巢发育时期各组织的脂肪酸组成

何先达，钟文杰，余金达，陈创思，熊永龙，王树启，温小波，陈翠英*

（1.汕头大学广东省海洋生物技术重点实验室，广东 汕头 515063；2.华南农业大学海洋学院，广东 广州 510642）

拟穴青蟹隶属于甲壳纲十足目短尾亚目梭子蟹科，因适应力强、肉质鲜美、营养丰富，经济价值高，是我国东南沿海重要的经济蟹类之一[1].在十足目甲壳类动物卵巢发育过程中，卵黄发生期是一个重要阶段，期间会呈现血淋巴中卵黄蛋白原浓度急剧增加和脂类快速蓄积的特点[2].脂类在甲壳类动物卵巢快速发育过程中有着十分重要的作用，它不仅提供卵巢必需脂肪酸、磷脂和某些激素的前体等必需营养成分，更是为胚胎发育提供营养和能量[3].磷脂通过促进卵黄发生期营养物质的快速积累和脂类代谢进而促进卵黄发生[4].功能性长链多不饱和脂肪酸（Long-chain polyunsaturated fatty acid，LC-PUFA），如花生四烯酸（20：4n-6，ARA）、二十碳五烯酸（20：5n-3，EPA）和二十二碳六烯酸（22：6n-3，DHA）不仅对细胞膜的流动性有着重要作用，还对卵巢的发育成熟，卵子的受精和孵化，甚至幼体的存活、生长和变态，均具有重要的营养作用[5-8].

目前，已有研究报道野外捕捞拟穴青蟹在不同卵巢发育阶段组织脂肪酸的组成特点[9-10]，发现卵巢指数会随着卵巢的发育成熟而显著增加，相反，肝胰腺指数则显著降低；肝胰腺和卵巢组织中的LC-PUFA含量也显著升高，尤其是EPA和DHA.由于野外捕捞和池塘养殖的生存环境及所摄食的饵料组成不同，青蟹组织脂类及其脂肪酸的组成也会有所不同，因此，本研究拟系统分析池塘养殖的拟穴青蟹不同卵巢发育时期卵巢、肝胰腺和肌肉组织不同脂类的脂肪酸组成变化，以帮助我们更好地了解人工养殖拟穴青蟹卵巢发育时期的脂类及脂肪酸营养需求，为亲蟹的培育和亲蟹人工配合饲料的开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 拟穴青蟹来源与样品采集

2020年9至10 月从广东省汕头市牛田洋拟穴青蟹养殖示范区获得卵巢发育处于不同时期的拟穴青蟹各6只，平均质量（165.45±36.34）g.实验蟹的日常投喂饵料主要为淡水螺丝、小毛蚶、短齿蛤等低值贝类.将青蟹麻醉后称重，解剖采集所有的卵巢、肝胰腺和肌肉组织并称重，分别计算青蟹的卵巢指数（GSI）和肝胰腺指数（HSI）.解剖时参考Islam等[9]的方法将拟穴青蟹卵巢发育阶段分为5个时期：Ⅰ期处于发育前期，卵巢呈半透明、薄而光滑；Ⅱ期是发育初期，此时卵巢呈白烛状；Ⅲ期颜色转浅黄则已进入卵黄发生初期；IV期卵巢体积逐渐增大，颜色转为黄色，卵巢发育即将成熟，进入卵黄发生旺期；V期卵巢变为橙/橘红色则发育至成熟期.组织样品经冷冻干燥后研磨粉碎密封保存于-20℃待测.具体公式如下：

1.2 总脂、中性脂、极性脂与脂肪酸组成检测

按照Bligh和Dyer[11]介绍的总脂提取方法，称取一定量组织冷冻干燥样品，用氯仿/甲醇提取卵巢发育不同阶段各组织的总脂.旋转蒸发干燥称重后，转移总脂至正相硅胶萃取小柱（SEP-PAK VAC PSA 6cc 500 mg，30/pk，美国Waters公司）内，后用氯仿和甲醇从总脂中分别洗脱中性脂和极性脂，旋转蒸发干燥后称重.然后根据Chen等[12]介绍的方法，将分离的极性脂和中性脂经0.5 mol/L氢氧化钠甲醇溶液皂化至油滴消失后，加入14%的三氟化硼甲醇溶液，75℃甲酯化处理15 min，接着加入1 mL的饱和氯化钠溶液和4 mL正己烷混合均匀静置1 h，取上清经0.22 μm针头滤膜过滤至棕色上样瓶中，充氮气后密封上机检测.

脂肪酸组成成分的检测按照Chen等[12]介绍的仪器设定参数和程序，采用日本岛津GC-17A气相色谱仪进行测定.色谱柱为安捷伦的CP-Sil88气相毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.2 μm），用纯度为99.999%的氮气以1.0 mL/min的流速进行载气.进样口和检测温度为250℃，溶剂延长时间为4 min，进样量为1 μL，进样分流比为20∶1.升温程序为：110℃保持3 min，以10℃/min的速度升至170℃保留10 min，然后以5℃/min的速度升至220℃并保持5 min.根据sigma公司的37种脂肪酸混标进行脂肪酸种类的鉴定，采用峰面积归一法进行定量分析，求得各脂肪酸的百分含量.

1.3 数据处理

实验结果用“平均值±标准误”（mean±SE）表示，使用SPSS 26.0软件对实验数据采用单因素方差分析，当数据为百分数时则先进行反正弦函数转换再处理，使用Tukey’s法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性标准.

2 结果与分析

2.1 不同卵巢发育时期卵巢指数和肝胰腺指数的变化

如图1（a）所示，卵巢在Ⅱ期到Ⅴ期的发育过程中，卵巢指数不断升高，在Ⅴ期高达16%，而肝胰腺指数在卵巢发育时期有所下降，但变化不明显.

图1 拟穴青蟹不同卵巢发育时期卵巢、肝胰腺指数及不同组织总脂含量变化

2.2 不同卵巢发育时期肝胰腺、卵巢和肌肉的总脂含量

如图1（b）所示，在不同卵巢发育时期，卵巢的总脂含量随卵巢发育成熟而显著增加（P＜0.05），在Ⅴ期可达到约27%.而肝胰腺的总脂含量先增加，并在Ⅱ期达到最高，然后逐渐降低，且Ⅴ期的总脂含量显著低于Ⅱ期的（P＜0.05）.肌肉的总脂含量较低（4%左右），并且在卵巢发育期间无显著变化（P＞0.05）.

2.3 不同卵巢发育时期肝胰腺、卵巢和肌肉的极性脂和中性脂的变化

如图2所示，肝胰腺中性脂的含量明显高于极性脂，并且随着卵巢的发育，中性脂含量逐渐升高至90%（Ⅴ期）.卵巢在发育初期（Ⅱ期）的中性脂含量较高，随着卵巢的发育，其含量显著降低（P＜0.05），并在卵巢发育后期与极性脂的含量基本相同，即约各占总脂的一半.肌肉的极性脂和中性脂在卵巢发育期间无显著变化，且极性脂含量明显高于中性脂，基本维持在总脂的80%左右.

图2 拟穴青蟹不同卵巢发育时期卵巢、肝胰腺和肌肉极性脂和中性脂含量变化

2.4 不同卵巢发育时期肝胰腺、卵巢和肌肉的脂类脂肪酸组成变化

由表1可知，卵巢极性脂脂肪酸主要为16：0、18：1n-9、ARA、EPA和DHA.其中，16：0、16：1n-9、16：1n-7和DHA的含量在卵巢发育后期显著增加（P＜0.05），而ARA和EPA的含量则显著降低（P＜0.05），且18：1n-9的含量也呈现下降的趋势.随着卵巢的发育成熟，n-6 PUFA的含量从20.30%大幅降低至10.73%.卵巢中性脂脂肪酸主要为16：0、18：0、16：1n-9、18：1n-9、ARA、EPA 和 DHA.在卵巢发育过程中，18：0、16：1n-7和ARA的含量显著降低（P＜0.05），而16：0、16：1n-9和DHA的含量显著增加（P＜0.05），EPA的含量则无显著变化.此外，MUFA和n-3 PUFA的含量与卵巢发育呈现正相关，而n-6 PUFA的含量在此过程中则急剧降低（15.13%→8.63%）.极性脂中，PUFA的含量最高，而在中性脂中，SFA的含量则相对较高.

表1 拟穴青蟹不同卵巢发育时期卵巢组织极性脂和中性脂脂肪酸组成变化

由表2可知，在肝胰腺中，中性脂和极性脂脂肪酸主要都是16：0、18：0、16：1n-9和18：1n-9，ARA、EPA和DHA的含量较低且在卵巢发育的不同阶段里没有明显变化.与卵巢不同，在肝胰腺中SFA的含量最高，MUFA次之，PUFA最少.

表2 拟穴青蟹不同卵巢发育时期肝胰腺组织极性脂和中性脂脂肪酸组成变化

由表3可知，在肌肉组织中脂肪酸主要都是 16：0、16：1n-9、18：0、18：1n-9、ARA、EPA和DHA.在卵巢发育时期，除了18：0、18：1n-9和ARA小幅度降低以及16：1n-9和DHA小幅度上升以外，其它主要脂肪酸没有明显变化.与卵巢极性脂相似的是，肌肉极性脂中PUFA的含量较高；但是在肌肉中中性脂SFA与PUFA的含量相近，且都大于MUFA的含量.

表3 拟穴青蟹不同卵巢发育时期肌肉组织极性脂和中性脂脂肪酸组成变化

4 讨论

4.1 不同卵巢发育时期卵巢、肝胰腺和肌肉的总脂、中性脂和极性脂含量的变化

在拟穴青蟹卵巢快速发育的过程中，卵巢指数和总脂含量大幅增加（7%—27%），而肝胰腺总脂的干重含量先增加后逐渐降低，说明此过程肝胰腺中的脂类至少存在部分向快速发育的卵巢转移，而肌肉中的总脂含量较低且期间无明显变化，脂类由肌肉转移到卵巢的可能性极低.这一点已在其他十足目甲壳类动物卵巢发育过程中被证实了，即肝胰腺中富含脂类的卵黄蛋白原能被转移到快速发育的卵巢中，为卵巢的发育提供物质基础[13-14].此外，拟穴青蟹的肝胰腺总脂含量先增加后减少的现象，可能是因为在卵巢发育初期，青蟹摄食量增加，此时的卵巢发育尚不成熟，从肝胰腺转移到卵巢的脂类有限，从外界获取的大量脂类暂时储存在肝胰腺中，造成肝胰腺总脂含量的暂时升高.这一结果与Wu等[10]和Tantikitti等[15]的在不同卵巢发育时期的野外捕捞拟穴青蟹肝胰腺总脂含量趋势相似，但却与锯缘青蟹不同，锯缘青蟹在卵巢发育这一阶段，肝胰腺脂类代谢活动加强，将从食物中摄取的脂类物质不断的合成脂肪，并迅速转移至正在发育的卵巢中[16]，因此其卵巢脂类积累与肝胰腺总脂含量变化关系不大.

在拟穴青蟹卵巢快速发育时期，卵巢的极性脂（主要为磷脂）的含量有明显的增加，由于甲壳动物合成磷脂的能力非常有限[17]，在此阶段拟穴青蟹卵巢磷脂的增加主要来源于外源性磷脂.而在卵巢发育成熟期，肝胰腺磷脂的含量明显下降，说明卵巢磷脂的增加可能有部分是来源于肝胰腺的转移.此外，肌肉组织在卵黄发生期中总脂含量、中性脂及极性脂变化均不明显，表明肌肉组织可能在卵黄发育过程中的参与程度不大.

4.2 不同卵巢发育时期卵巢、肝胰腺和肌肉的脂肪酸组成的变化

在拟穴青蟹卵巢、肝胰腺和肌肉中，LC-PUFA的含量较高，且极性脂中LC-PUFA的含量都高于中性脂，不饱和脂肪酸的含量显著高于饱和脂肪酸的含量，同时n-3 PUFA的含量一般高于n-6 PUFA，n-3/n-6的比值在1～3之间波动，这与在野外捕捞的拟穴青蟹[9-10]和锯缘青蟹[17]上的研究结果相似，是海洋十足目甲壳类动物脂类脂肪酸的典型特征[18].

当卵巢从初期发育至卵黄发生期时，卵巢极性脂和中性脂的ARA含量均显著降低.ARA是前列腺素和其他类二十烷酸的合成前体，而前列腺素不仅参与机体的生殖、呼吸和消化等生理活动，还可抑制脂质的分解[19].因此，卵巢在Ⅱ期时高含量的ARA可能抑制脂肪的分解利用，促进脂肪在卵巢中的积累，而在Ⅲ期后，卵巢发育及卵子的形成需要较多能量，此时脂质的分解利用开始加强，ARA的含量显著低于Ⅱ期时的含量，并逐渐趋于稳定.积累在卵巢中的PUFA含量显著高于肝胰腺，表明PUFA尤其是DHA、EPA和ARA对于拟穴青蟹卵巢发育有着十分重要的作用.已有实验证明，PUFA能促进甲壳类动物卵巢的发育、产卵和卵的孵化[6-7].在锯缘青蟹[16]和中华绒螯蟹[20]的研究中发现，流产蟹肝胰腺中EPA和DHA的含量明显高于抱卵蟹，说明可能是流产蟹肝胰腺中的PUFA尤其是EPA和DHA没有及时转移到卵巢中，导致胚胎发育不良，引起流产.Wen等[21]对中华绒螯蟹卵巢发育的研究中发现，LC-PUFA能显著提高亲蟹的产卵量和孵化率.若缺乏EPA和DHA则会显著影响中华绒螯蟹的生殖性能以及幼体质量.因此，在卵巢的快速发育时期，EPA和DHA等LC-PUFA在卵巢中的积累，不仅促进拟穴青蟹卵巢的发育成熟，也可为卵子的受精与孵化提供必需的营养.

在拟穴青蟹的卵巢和肝胰腺的脂肪酸组成中，16：0、18：0和18：1n-9是主要成分，这些脂肪酸正是拟穴青蟹卵巢发育的主要能量来源.特别是在肝胰腺组织中，包括16：0和18：0在内的SFA含量很高，是PUFA含量的2～3倍，高含量的SFA是肝胰腺的脂类储存能量的主要形式.肌肉和卵巢的主要脂肪酸都是LC-PUFA，肌肉中的LC-PUFA含量比卵巢的高，且主要是ARA、EPA和DHA.与卵巢组织一样，高含量的LC-PUFA是肌肉细胞代谢活动的基础，而且n-3 LC-PUFA含量的提高有利于提高甲壳动物的渗透压调节能力[22]，这可能是肌肉中LC-PUFA含量较高的重要原因之一.

本研究分析了人工池塘养殖拟穴青蟹不同卵巢发育时期中卵巢、肝胰腺和肌肉脂类含量及其脂肪酸组成的变化，为进一步了解养殖拟穴青蟹过程中卵巢发育时期对脂类和脂肪酸的营养需求提供了参考资料，为拟穴青蟹膏蟹的培育及其人工配合饲料的研发提供了一定的理论依据.