干旱和盐胁迫对向日葵叶片蜡质积累的影响及蜡质烷烃合成基因的克隆

隗正阳，安沛沛，吴洪启，刘 乐，肖恩时，景 兵，王中华

(西北农林科技大学农学院，陕西 杨凌 712100)

植物表皮蜡质覆盖在植物表皮细胞最外层，是由超长链脂肪酸及其衍生的醇、烷烃、醛、酮等组成的疏水性混合物，其主要功能是限制植物非气孔水分流失，进而提高植物抗旱性[1-3]。同时表皮蜡质还可使植物免受紫外线伤害及减少植物表面空气污染物的沉积，在植物育性、植物-病原菌互作方面也具有重要作用[4-7]。

植物叶表皮蜡质的积累是植物体内重要的生理过程，受环境胁迫的影响较为严重[8]。通常情况下，干旱和盐胁迫能够导致叶片蜡质显著增加。Kosma等[5]研究发现，干旱和盐胁迫8d后拟南芥叶片蜡质总含量分别增加了80%和75%；所有蜡质组分中，烷烃含量增加最明显，可分别增加98%和93%。这种变化与角质层渗透性降低有关，并且可能有助于植物在水分缺失条件下生长。同样，干旱胁迫后胡杨、盐生水芹和番茄等植物叶片蜡质明显增加，而这种变化也是由烷烃组分含量增加导致[9-11]。以上研究表明，蜡质组分中烷烃在植物响应干旱和盐胁迫中起着重要作用。然而，烷烃作为植物表皮蜡质的重要组成成分，其合成的具体机制仍不清楚[12-13]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)和玉米(Zeamays)相应突变体中的研究证明了CER1和CER3及其同源基因在烷烃合成中的重要作用，拟南芥中改变CER1(At1G02205)和CER3(At5G57800)的表达都直接影响其烷烃含量[7]。在豌豆(Pisumsativum)和蓝藻(Cyanobacteria)的研究中证明烷烃的合成需要两个步骤：首先脂酰辅酶A还原酶将脂酰辅酶A转化为中间体醛，然后醛脱羰基酶催化中间体醛脱羰基生成烷烃[14-15]。基于蓝藻中烷烃合成的步骤及拟南芥突变体表型的研究，CER1蛋白被认为是一种催化醛脱羰基酶，而CER3蛋白被认为是一种可以将脂酰辅酶A还原为醛的酶[6,7]。Bernard等[16]利用改造的酵母证明了CER1和CER3蛋白能够相互作用形成二聚体酶复合物，并在辅助因子CYTB5的促进作用下将脂酰辅酶A转化为烷烃。

向日葵(HeliauthusannuusL.)是我国干旱、半干旱地区的重要油料作物，干旱、盐胁迫能够导致向日葵产量和种子含油量大幅下降，是限制向日葵生产的主要因素[17]。目前关于向日葵表皮蜡质与干旱和盐胁迫的研究鲜有报道，因此探究胁迫条件下向日葵表皮蜡质的变化，挖掘表皮蜡质相关合成基因的工作尤为必要。本研究拟分析向日葵叶片表皮蜡质的组成及其在干旱和盐胁迫下的变化，在向日葵基因组中检索到6个烷烃合成候选基因，分析候选基因的组织表达谱，并在向日葵叶片中克隆其中的两个候选基因HaCER1-1和HaCER3-1，利用qRT-PCR分析HaCER3-1基因在胁迫下的表达量变化，研究成果可望为后续研究向日葵中烷烃合成机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为油用向日葵(HeliauthusannuusL.)高代自交系‘SKY02R-32’。供试材料种植于10 cm× 10 cm的塑料花盆内，在培养箱(GDN型，宁波)内培养，光周期为16 h/8 h，温度为22℃/21℃。

1.2 试验方法

1.2.1 干旱、盐胁迫下向日葵叶片表皮蜡质提取 对三周龄的向日葵进行缺水、200 mmol·L-1氯化钠(NaCl)、15% 聚乙二醇6000(PEG6000)和H2O(对照组)处理，除缺水处理外各溶液均取100 mL浇灌根系，处理一周后剪取所有叶片提取表皮蜡质，每个处理设3个生物学重复，利用ImageJ软件计算叶面积，用氯仿浸提表皮蜡质同时加入20 μg C24烷烃作为内参，浸提液过滤至烧杯内，挥发至0.5～1.0 mL时转移到GC瓶内，利用氮吹仪吹干，然后加入40 μL吡啶和40 μL BSTFA[N,O-双(三甲基硅烷基三氟乙酰胺)]混匀并置于70℃水浴锅内反应60 min，反应结束用氮气吹干GC瓶内液体，最后加入800 μL氯仿用于气相色谱—质谱联用仪(GC-MS，GCMS-QP2010S，日本岛津)分析。

1.2.2 GC-MS分析 利用气相色谱—质谱联用仪检测浸提的蜡质混合物获得各成分的离子峰，通过检索质谱数据库对各离子峰进行定性，利用Lab Solution软件对各离子峰进行积分，获得峰面积，根据C24内标的加入量对所有成分进行定量分析。计算公式如下：

M=(20·S峰)/(S叶·S内标)

(1)

式中，M表示表皮蜡质某一成分绝对含量(ng·cm-2)，S峰表示该成分离子峰面积(cm2)，S叶表示该样品叶片表面积(cm2)，S内标表示C24烷烃的离子峰面积(cm2)。

1.2.3 烷烃合成候选基因生物信息学分析 利用拟南芥烷烃合成基因AtCER1(AT1G02205)和AtCER3(AT5G57800)序列在向日葵数据库(https://www.heliagene.org/)中检索相应同源基因，利用在线工具Pfam(http://pfam.xfam.org)分析蛋白结构域并利用TBtools作图，运用MEGA6软件的邻位相连法构建系统进化树。

1.2.4 烷烃合成候选基因表达模式分析 在向日葵转录组数据库(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/plants/FATAL/cgi/HELAN.cgi)中下载烷烃合成候选基因的表达谱数据，利用TBtools软件对数据进行可视化。

1.2.5HaCER1-1和HaCER3-1的克隆 利用Primer Premier 5进行引物设计(表1)，以‘SKY02R-32’叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，将扩增产物纯化回收后备用。利用XbaⅠ酶将pCAMBIA2300载体线性化，用无缝克隆试剂盒(DT101-01，DiNing，北京)将目的片段与载体连接后转化大肠杆菌感受态DH5α，进行抗性筛选，挑选单克隆，PCR鉴定后送往上海生工生物股份有限公司测序。测序正确的菌液扩大培养后用质粒小提试剂盒(StarPrep，GenStar，北京)提取质粒“pCAMBIA2300-HaCER1”和“pCAMBIA2300-HaCER3”。

1.2.6 NaCl和PEG处理下HaCER3-1的表达分析 分别用200 mmol·L-1NaCl(溶剂为H2O)、15% PEG6000和H2O(对照组)100 mL浇灌四叶期向日葵幼苗，处理3、6、12、24 h时剪取叶片，每个处理取3个生物学重复，利用RNA提取试剂盒(贝贝生物科技有限公司)提取RNA，反转录合成cDNA(Vazyme，南京)用于qRT-PCR分析，使用QuantStudio3(美国)进行qRT-PCR分析，每个反应设置3个技术重复，反应体系及反应程序按照北京康润诚业生物科技有限公司的实时荧光定量试剂盒(A311，康润诚业，北京)说明书确定。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 干旱、盐胁迫下向日葵叶片表皮蜡质分析

为了研究干旱及盐胁迫对向日葵幼苗表皮蜡质的影响，提取了胁迫处理后向日葵的叶表皮蜡质进行了GC-MS分析。图1显示，正常状态下三周龄向日葵幼苗叶片表皮蜡质主要成分为初级醇、烷烃和脂肪酸等，初级醇含量达到0.988 μg·cm-2，约占叶片蜡质总量的70%～80%，烷烃含量为0.12 μg·cm-2，占10%～14%，脂肪酸含量为0.114 μg·cm-2，占9%～13%。初级醇共鉴定到6种，烷烃鉴定到11种，脂肪酸鉴定到6种。碳链长度分析结果显示，初级醇的碳链长为22-34；烷烃碳链长为25-35，C27和C29烷烃含量最高；脂肪酸碳链长为16-28。缺水、氯化钠和PEG的处理均能提高向日葵叶片表皮蜡质总量，且缺水和氯化钠处理下表皮蜡质总量升高最为显著，分别提高了8.8%和8.5%，其中升高的主要是烷烃和脂肪酸的含量，缺水和盐胁迫处理下，烷烃单位叶面积升高量分别为62.5%和47%，脂肪酸升高量为45%和49%(表2)。

2.2 烷烃合成候选基因生物信息学分析

利用拟南芥烷烃合成基因AtCER1(AT1G02205)和AtCER3(AT5G57800)序列在向日葵基因组中进行同源比对，共获的3个AtCER1同源基因和3个AtCER3同源基因，将其命名为HaCER1-1(HanXRQr2_Chr16g0763931)、HaCER1-2(HanXRQr2_Chr15g0714831)、HaCER1-3(HanXRQr2_Chr13g0570411)、HaCER3-1(HanXRQr2_Chr02g0049271)、HaCER3-2(HanXRQr2_Chr06g0262671)和HaCER3-3(HanXRQr2_Chr05g0202951)。氨基酸序列分析发现这6个序列与其他物种中的同源序列都含有两个完整的保守结构域-脂肪酸脱氢酶超家族(FA_hydroxylase)和Wax2_C(图2)，说明这两个结构域对于烷烃的合成至关重要。系统进化树分析表明3个HaCER1蛋白能够与其他物种CER1同源蛋白聚为一类；3个HaCER3蛋白同样与其他CER3同源蛋白聚为一类；HaCER3-1与拟南芥AtCER3的进化关系最近；同时向日葵的这6个蛋白与双子叶植物亲缘关系更近(图2)。

表2 不同处理下向日葵叶片表皮蜡质各组分的含量Table 2 The content of the cuticular wax compositions in sunflower leaves/(μg·cm-2)

注：柱形图下方各数字表示该化合物所含碳原子数Note：Number below in each column is the carbon atom number of thecorresponding chemical compound图1 干旱、盐胁迫下向日葵叶片表皮蜡质主要组分Fig.1 Main components of sunflower leaf cuticular wax under drought and salt stress

2.3 烷烃合成候选基因表达模式分析

通过转录组数据库获得各基因在不同组织中表达的RPKM值，结果显示6个基因在根中的表达都很低，在茎中只有HaCER3-1和HaCER3-2表达，在叶片中HaCER1-1和HaCER3-1两基因的表达量最高，可能参与了叶片中烷烃的合成。而在向日葵花冠中HaCER1-2、HaCER1-3、HaCER3-2和HaCER3-3均有较高的表达量(图3)。

2.4 HaCER1-1和HaCER3-1的克隆

对候选基因HaCER1-1和HaCER3-1进行PCR扩增后，其目的片段与预期大小一致，约1 700 bp。经测序两个基因的CDS序列分别为1 869 bp和1 674 bp(图4)，分别包含一个完整开放阅读框，编码氨基酸个数分别为622和557。

2.5 NaCl和PEG处理下HaCER3-1的表达分析

qRT-PCR结果表明，HaCER3-1的表达受到NaCl和PEG诱导，在12 h内随着处理时间的增加，基因的表达量均呈逐渐上升的趋势，在第12 h时表达量达到最大值，200 mmol·L-1NaCl溶液的处理可以使HaCER3-1增加10倍以上，15% PEG6000溶液的处理可以使其增加3倍以上；在第24 h时基因的表达量下降，但仍高于0 h(图5)。由此推测HaCER3-1在响应干旱及盐胁迫过程中起重要作用。

3 讨论与结论

不同植物的表皮蜡质组分及比例均有不同，拟南芥叶片表皮蜡质主要由烷烃、醇类和脂肪酸组成，小麦叶片表皮蜡质中主要为初级醇、烷烃和二酮，番茄叶片表皮蜡质主要由烷烃、初级醇和三萜类组成，糜子的表皮蜡质主要是初级醇和烷烃，约占蜡质总量的95%[18-21]。本研究通过GC-MS技术分析了油葵自交系‘SKY02R-32’叶片的表皮蜡质组分，发现向日葵幼苗表皮蜡质主要成分为初级醇、烷烃和脂肪酸等。

注：除向日葵外，其他物种蛋白ID如下AtCER1(NP_001184890.1);AtCER1-like1(NP_171721.3);AtCER3(NP_200588.2);BnCER1(XP_013722199.1);ZmGL1(ONM55119.1);OsGL1-1(XP_015651446.1);OsGL1-2(XP_015623214.1);OsGL1-3(XP_015641638.1);OsGL1-4(XP_015627618.1);OsGL1-5(Q7XDI3.1);OsGL1-6(XP_015624738.1);OsGL1-7 (CAE03390.2);CsCER1(XP_004153200.1);CsCER3(XP_004149879.1)图2 系统进化树和蛋白保守结构域图Fig.2 The phylogenetic tree and protein conserved domain analysis

图3 基因组织表达谱Fig.3 Gene expression profiles in different tissues

图5 胁迫下HaCER3-1的表达量变化Fig.5 HaCER3-1 expression at different time under different abiotic stresses

图4 HaCER1-1和HaCER3-1的序列Fig.4 Sequences of HaCER1-1 and HaCER3-1

在许多植物中干旱胁迫能够诱导植物单位叶面积表皮蜡质含量的提升，包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、小麦(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、烟草(Nicotianatobacum)等[5,22-26]。本试验对向日葵干旱及盐胁迫后的叶片表皮蜡质进行分析，发现干旱胁迫和盐胁迫均能提高向日葵叶片单位面积蜡质总量。虽然较多研究表明植物表皮蜡质与其抗旱性密切相关，但是表皮蜡质组分、结构与植物抗旱性的关系仍然缺乏深入研究[27]。Leide等[28]发现角质层透水性与角质层的厚度无关，而是与其特定组分如烷烃有关。Parsons等[29]在辣椒(Capsicumannuum)采后失水率有关的研究中同样发现，辣椒采后失水率的高低与蜡质总量无关，而与烷烃比例呈负相关。Kim等[30]对18个芝麻品种进行缺水处理，之后分析了这些品种的叶片表皮蜡质变化，结果显示这些品种的叶蜡中平均59%为烷烃，干旱胁迫后叶蜡总量增加34%，其中主要是烷烃的增加。本研究发现干旱和盐胁迫后向日葵叶片表皮蜡质总量有明显提升，其中烷烃含量的提高最为明显，推测烷烃对向日葵响应干旱、盐胁迫，提高保水能力具有重要意义。

Eceriferum(CER)家族是胁迫条件下调控表皮蜡质合成的主要基因家族之一，目前CER基因在拟南芥、小麦、玉米、番茄(Lycopersiconesculentum)、黄瓜(Cucumissativus)等植物中都有报道[6,31-34]。CER1和CER3蛋白被认为是烷烃合成途径的关键酶[7,16,35]。二者在表达模式、结构域方面有许多相似之处，如两种蛋白的N端都有一个富含组氨酸的结构域-脂肪酸脱氢酶超家族，C端都有一个WAX2结构域[9]，本研究在向日葵数据库内共检索到3个CER1同源蛋白和3个CER3同源蛋白，6个蛋白序列均有完整的保守结构域，并且系统进化树表明6个蛋白与已知的CER1和CER3同源蛋白进化关系较近。通过转录组数据分析6个基因的表达谱，发现在根、茎和叶组织中表达的有HaCER1-1、HaCER3-1和HaCER3-2，推测这三个基因在向日葵叶片合成烷烃的过程中起作用。本研究克隆了其中两个烷烃合成候选基因，命名为HaCER1-1和HaCER3-1，其CDS长分别为1 869、1 674 bp。利用qRT-PCR分析了NaCl和PEG处理下HaCER3-1的表达量变化，发现HaCER3-1的表达有明显的上调。因此推测HaCER3-1可能参与向日葵叶片中烷烃合成，在向日葵响应干旱和盐等胁迫，适应缺水环境的过程中具有重要作用。

干旱和盐胁迫是限制植物生产力的主要因素之一，转基因育种和分子设计育种是培育抗旱耐盐品种最经济有效的途径之一，因此发现和挖掘向日葵抗逆基因至关重要。本研究分析了向日葵幼苗叶片表皮蜡质组成及干旱、盐胁迫下其表皮蜡质的变化，并克隆了两个烷烃合成候选基因HaCER1-1和HaCER3-1，利用qRT-PCR技术分析了胁迫下HaCER3-1的表达量变化，为后续深入研究向日葵烷烃合成的机制奠定基础。