拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗生长、抗氧化系统及枯萎病防效的影响

马光恕，张 渟，李润哲，李 梅，廉 华

(1.黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，黑龙江 大庆 163319；2中国农业科学院植物保护研究所，北京 100081)

黄瓜(CucumissativusL.)属葫芦科甜瓜属植物，是我国具有最大种植面积和最广泛栽培范围的主要蔬菜作物之一[1]。据联合国粮食及农业组织数据显示，2020年全球的黄瓜总生产面积达225万hm2，我国达到127万hm2，占全球的56.4%；全球的黄瓜总产量为9035万t，我国达到7336万t，占全球的81.2%[2]。而且我国黄瓜种植面积、产量持续呈现正增长趋势，目前在蔬菜种植面积中占比约6%、产量占比近10%。随着种植面积逐年增加，特别是设施生产中，持续连作造成的土传病害加重逐渐成为影响我国设施黄瓜生产的最大障碍[3]，黄瓜枯萎病就是其中影响最大的病害之一。黄瓜枯萎病是由尖孢镰孢黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumeriumOwen，FOC)侵染引起的真菌病害，发病周期涉及黄瓜整个生长期，发病率通常为10%～30%，严重年份可达50%；产量损失10%～50%，甚至绝收[4]。长期连作、土壤肥力下降、微生物菌群失衡是导致该病害日渐严重的主要原因[5]。目前，黄瓜枯萎病的防治趋向低毒、低残留及绿色生态型发展，生物防治因其安全、友好、成本低、来源广等优点，逐渐成为当今枯萎病防治的研究热点[6]，木霉(Trichodermaspp.)是目前研究和应用最为广泛的生防真菌类型之一。

木霉菌是真菌界、双核菌门、半知菌亚门、丝孢纲丛、梗孢目、丛梗孢科、木霉属一种真菌[7]，Ahmad等[8]研究表明，木霉菌通过分泌植物生长激素等物质，具有促进植物生长的功能。Harman[9]研究表明，木霉菌通过分泌细胞壁降解酶类和次级代谢产物，可以诱导植物抗性提高。植物抗性主要通过防御酶系统的应答体系表现出来，防御酶系统主要包括过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)等，防御酶活性大小与植物抗病性之间呈一定正相关关系[10]。当植物受病原菌侵染后，木霉等生防微生物能够诱导植物抗病相关防御酶发生变化，增强植物体的抗病防御功能，而防御反应与各种保护性酶活性的提高关系密切[11]。同时，当植物感病后，会造成细胞内电解质大量外渗，丙二醛(MDA)和质膜透性均可以作为膜脂过氧化作用强弱的指标，在植物的抗病应答中发挥重要作用[12]。关于木霉促进植物生长、提高抗病性以及改善植物体内抗氧化系统功能方面的研究报道较多，如Mohamed等[13]研究了阴沟肠杆菌PS14与棘孢木霉(Trichodermaasperellum)T34对马铃薯青枯病的防治效果，结果表明二者联合施用后提高了植株POD、脂肪氧合酶和PPO活性，青枯病的温室发病率下降幅度达10.7%～26.5%，大田发病率下降幅度达26.6%～36.6%。李玲等[14]研究表明，绿木霉(Trichodermaviride)DB14、加纳木霉(Trichodermaghanense)DB35孢子悬浮液对盆栽小麦白粉病的防效分别可达68.63%、66.67%；喷施2种木霉菌均提高了小麦叶片叶绿素含量和SOD、POD、CAT活性，分别提高69.06%、96.64%、60.38%、54.46%和66.79%、86.43%、34.97%、37.62%；同时降低了MDA含量，分别降低32.97%和32.43%，说明喷施木霉可增强小麦抗逆性。宋明霞等[15]研究了绿色木霉和枯草芽孢杆菌对番茄幼苗生长的影响，结果显示施加混合菌液处理番茄株高、茎围、叶片SPAD值分别比单施绿色木霉增加了23.95%、6.90%、14.69%，番茄叶片PSII最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)、电子传递速率(ETR)分别比单施绿色木霉增加了13.43%、98.20%、29.93%，说明混合菌液更能激活番茄光合系统的活性，提高光合速率，促进番茄幼苗的生长。

木霉菌在其生命过程中可以产生菌丝体、分生孢子和厚垣孢子3种繁殖体，目前国内外已经有50多种木霉商品化制剂[16]，这些制剂均为木霉菌分生孢子制剂或分生孢子与菌丝体混合制剂。厚垣孢子是木霉菌抵抗逆境条件而产生的细胞壁加厚的孢子，与分生孢子相比，具有耐干燥、对土壤抑菌作用不敏感、存活期长、对病原微生物的生防效果不易受环境影响等优点，因此木霉菌厚垣孢子制剂的商品化开发将成为木霉菌制剂的发展趋势[17]，开发性能稳定的木霉菌厚垣孢子制剂，对于保证植物高产和优质生产具有重要意义。本试验选择的拟康氏木霉菌(Trichodermapseudokoningii)886，在前期对黄瓜枯萎病菌平板对峙试验中抑制率达到74.17%且田间防治效果达到78.64%，所以本试验以其为试验菌种，选择拟康氏木霉886厚垣孢子菌剂，系统研究其对黄瓜幼苗生长、抗氧化系统及黄瓜枯萎病防治效果的影响，深化木霉菌剂提高黄瓜抗枯萎病侵染的生理机制，为“农药化肥双减”和“农药零增长”的推行提供技术支持，为木霉菌剂未来研发和推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试黄瓜品种 供试黄瓜品种为‘长春密刺’，购买于山东新泰市裕园种业有限公司。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)参照Li等[18]方法；尖孢镰刀菌选择培养基参照张树生等[19]方法；木霉选择性培养基(PDAm)参照Masunaka等[20]方法；木霉厚垣孢子发酵培养基参照张林[21]方法。

1.1.3 供试菌株 拟康氏木霉菌Trichodermapseudokoningii886，由中国农业科学院植物保护研究所木霉菌研究组提供。

1.1.4 供试基质材料 试验中所使用的基质材料是草炭和蛭石的混合物，草炭∶蛭石(体积比)= 2∶1(基质基本农化性状如下：pH 6.92，有机质34.5%，碱解氮760 mg·kg-1，速效磷53 mg·kg-1，速效钾157 mg·kg-1)。基质过筛(1 mm)后于烘箱中160℃高温灭菌2 h，自然冷却后继续在160℃烘2 h后放凉备用。

1.2 尖孢镰刀菌粉剂和木霉孢子粉剂的制备

1.2.1 尖孢镰刀菌粉剂的制备 将黄瓜枯萎病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上，28℃下培养3 d，从菌落边缘取直径5 mm的菌饼5块，接种在含有100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)的250 mL的三角瓶中，28℃、120 r·min-1摇床振荡培养7 d，用双层纱布过滤去除菌丝，滤液经5 000 r·min-1离心10 min，沉淀后的孢子重新悬浮于与发酵液等量的无菌水中，加入3%硅藻土，混匀、抽滤、干燥，制成病原菌孢子粉剂。为计算粉剂中病原菌孢子含量，将粉剂用无菌水梯度稀释后，涂布于尖孢镰刀菌选择培养基，放置1 h 后将培养平板倒置于28℃培养箱培养3～4 d，计菌落数，计算孢子含量为1.9×107cfu·g-1，按照试验要求计算应用剂量。

1.2.2 拟康氏木霉厚垣孢子粉剂的制备 将拟康氏木霉菌886接入到灭菌的木霉菌厚垣孢子发酵培养基中，于28℃、200 r·min-1摇床中发酵 7 d。发酵液用双层纱布过滤后，将滤液离心得到厚垣孢子，用无菌水反复冲洗3次，即得干净的木霉菌厚垣孢子。用无菌水配制成孢子悬浮液，涂布于木霉选择培养基上，在25～28℃下倒置培养1～2 d，记录菌落数，计算木霉厚垣孢子含量。发酵液加入3%硅藻土，混匀、抽滤、干燥，碾碎成粉末，获得木霉厚垣孢子粉剂。平板计数法测得木霉菌886粉剂浓度为4.7×107cfu·g-1，按照试验要求计算应用剂量。

1.3 试验方法

2019年5—8月，在黑龙江八一农垦大学教学基地塑料大棚内开展相关试验研究。将灭菌基质材料装入塑料材质的育苗盘(34.5 cm×24 cm×11 cm)中，每盘基质重2.5 kg。试验在施用104cfu·g-1浓度的尖孢镰刀菌粉剂基础之上，其分别与不同浓度拟康氏木霉菌厚垣孢子菌剂拌入装有灭菌土的育苗盒中，以不施用拟康氏木霉菌剂为对照。2019年5月20日，播种催芽处理后的黄瓜种子，每盘播80粒，出苗后选留50株。播种后每隔2 d浇施一次无菌水，每盘浇施1 000 mL，保持黄瓜正常生长状态。

试验在接种104cfu·g-1浓度的尖孢镰刀菌粉剂基础上，共设置6个不同浓度的拟康氏木霉菌剂处理，即103、104、105、106、107cfu·g-1,分别记为T1、T2、T3、T4、T5,并以不施用拟康氏木霉菌剂为对照(CK)。采用随机区组设计，每个处理4盘，重复3次。

在黄瓜播种后15 d，测定防病效果；在黄瓜播种后30 d取其植株，每个处理选取30株(每个重复10株)，用于测定黄瓜幼苗形态指标和物质积累量指标，计算根冠比和壮苗指数；在黄瓜播种后15 d和30 d取其植株，每个处理选取30株，用于测定黄瓜幼苗抗氧化系统相关指标。

1.4 试验测定指标与方法

1.4.1 形态指标测定 株高：植株的茎基部到生长点之间的距离，用直尺测定；茎粗：植株子叶节下1 cm处粗度，用游标卡尺测定；叶面积：用剪纸称重法测定。

1.4.2 物质积累量指标测定 利用清水反复冲洗植株，再用吸水纸吸干，按照地上部与地下部分开后测其鲜重；而后将鲜样在105℃杀青15 min后，在70℃烘至恒重，用1/1 000电子天平分别测定地上部与地下部干重。

根冠比计算：根冠比=地下部鲜重/地上部鲜重

壮苗指数计算：壮苗指数=(茎粗/株高+地下部干重/地上部干重)×全株干重

1.4.3 抗氧化系统相关指标测定 丙二醛(MDA)：硫代巴比妥酸法；脯氨酸(Pro)：酸性茚三酮显色法；质膜透性：相对电导率法；超氧化物歧化酶(SOD)活性：氮蓝四唑光化还原法；抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性：抗坏血酸法；过氧化氢酶(CAT)活性：紫外吸收法；过氧化物酶(POD)活性：愈创木酚法；多酚氧化酶(PPO)活性：参照Zhao等[22]的方法。

1.4.4 抗病性指标测定方法 抗病性指标包括植株发病率、病情指数、防治效果。黄瓜播种后15 d，调查发病株数占调查总株数的百分比，计算各处理的发病率。黄瓜苗期枯萎病参照张素平[23]的分级标准，病情指数参照宗兆锋等[24]的计算方法，具体如下：0级：无症状；1级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积不超过总面积的50%；2级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积超过总面积的50%；3级：叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活；4级：全株严重萎蔫，以致枯死。

病情指数= [∑(病级株数×代表级数)/(植株总数×最高代表级值)]×100%

防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%

1.5 数据分析

采用Excel 2007软件进行数据处理，用DPS 7.05软件进行数据统计和方差分析，不同处理间数据的多重比较采用Duncan新复极差法检验(P<0.05)；采用Excel 2007软件作图。

2 结果与分析

2.1 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗形态指标的影响

注：CK，不施用拟康氏木霉菌剂；T1，103 cfu·g-1拟康氏木霉菌剂；T2，104 cfu·g-1拟康氏木霉菌剂；T3，105 cfu·g-1拟康氏木霉菌剂；T4，106 cfu·g-1拟康氏木霉菌剂；T5，107 cfu·g-1拟康氏木霉菌剂。图中正负误差线表示标准差大小，不同小写字母表示在同一时期各处理之间差异显著(P<0.05)。下同。Note：CK，0 cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T1，103 cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T2，104 cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T3，105cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T4，106cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T5，107cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents.Values in the chart are standard error.Different lowercase letters in the same period indicate that the difference reach a significant level(P<0.05)among different treatments.The same below.图1 拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗株高和茎粗的影响Fig.1 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on plant height and stem diameter of cucumber seedlings

2.1.1 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗株高和茎粗的影响 如图1所示，在黄瓜播种后30 d，T3处理黄瓜幼苗株高和茎粗均最高，分别为17.28 cm和4.24 mm；且显著高于其他处理，株高和茎粗分别比CK、T1、T2、T4、T5高70.93%、27.78%、9.43%、5.82%、22.28%和50.76%、20.18%、7.56%、4.28%、15.37%；T2黄瓜幼苗株高和茎粗和T4之间差异不显著，但二者均显著高于CK、T1、T5，T2分别高56.19%、16.77%、11.74%和40.17%、11.73%、7.26%，T4分别比CK、T1、T5高61.53%、20.76%、15.56%和44.58%、15.25%、10.64%；T5黄瓜幼苗株高和茎粗和T1之间差异不显著，但二者均显著高于CK，T5分别比CK高39.78%和30.68%，T1分别比CK高33.76%和25.45%；CK黄瓜幼苗的株高和茎粗最低，分别为10.11 cm和2.81 mm。说明适量木霉菌剂处理即T3对黄瓜幼苗株高和茎粗具有更好促进效果，为以后幼苗物质积累和壮苗形成提供基础条件。

2.1.2 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗叶面积和根体积的影响 如图2所示，在黄瓜播种后30 d，T3黄瓜幼苗叶面积和根体积最高，分别为37.84 cm2和0.51 cm3；T3黄瓜幼苗叶面积与T4之间差异不显著，但均显著高于CK、T1、T2、T5，分别高105.41%、55.44%、15.50%、42.99%和92.30%、45.52%、8.13%、33.87%；T3黄瓜幼苗根体积显著高于CK、T1、T2、T4、T5，分别高200.00%、54.55%、21.43%、15.91%、37.84%；T4黄瓜幼苗叶面积和根体积与T2之间差异不显著，但均显著高于CK、T1、T5，叶面积分别高92.30%、45.52%、33.87%和77.84%、34.58%、23.80%，根体积分别高158.82%、33.33%、18.92%和147.06%、27.27%、13.51%；T1黄瓜幼苗叶面积和根体积与T5之间差异不显著，但均显著高于CK，分别高32.15%、43.65%和94.12%、117.65%；CK黄瓜幼苗的叶面积和根体积最低，分别为18.42 cm2和0.17 cm3。说明适量木霉菌剂处理对黄瓜幼苗叶面积和根体积具有促进效果，为以后黄瓜壮苗形成提供保证。

2.1.3 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗根冠比和壮苗指数的影响 如图3所示，在黄瓜播种后30 d，T3黄瓜幼苗根冠比和壮苗指数最高，分别为0.103和0.108；T3黄瓜幼苗根冠比和壮苗指数显著高于其他处理，分别比CK、T1、T2、T4、T5高51.47%、43.06%、10.75%、8.42%、37.33%和68.75%、30.12%、13.68%、10.20%、21.35%；T4幼苗根冠比和壮苗指数与T2之间差异不显著，但均显著高于CK、T1、T5，根冠比分别高39.71%、31.94%、26.67%和36.76%、29.17%、24.00%，壮苗指数分别高53.13%、18.07%、10.11%和48.44%、14.46%、6.74%；T1黄瓜幼苗根冠比和壮苗指数与T5之间差异不显著，但均显著高于CK，分别高5.88%、29.69%和10.29%、39.06%；CK黄瓜幼苗根冠比和壮苗指数最低，分别为0.068和0.064。说明适量木霉菌剂处理对黄瓜根冠比和壮苗指数具有促进效果，为提高黄瓜抗逆性提供了基础保证。

图2 拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗叶面积和根体积的影响Fig.2 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on leaf area and root volume of cucumber seedlings

图3 拟康氏木霉菌剂对黄瓜根冠比和壮苗指数的影响Fig.3 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on root shoot ratio and strong seedling index of cucumber

2.2 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗抗氧化指标的影响

2.2.1 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗叶片过氧化氢酶活性的影响 如图4所示，在黄瓜播种后15 d和30 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片过氧化氢酶活性均显著高于CK。在黄瓜播种后15 d和30 d，黄瓜幼苗叶片过氧化氢酶活性随处理浓度增加呈先升高后降低趋势，且T3最高，分别为113.87 U·g-1·min-1和167.22 U·g-1·min-1；黄瓜播种后30 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜叶片过氧化氢酶活性均比播种后15 d有所提高。T3显著高于其他处理，在黄瓜播种后15 d分别比其他处理(CK、T1、T2、T4、T5)高160.95%、33.86%、26.49%、9.88%、47.77%，在黄瓜播种后30 d分别比其他处理(CK、T1、T2、T4、T5)高119.96%、56.49%、15.87%、6.16%、69.88%；其次，T4对叶片过氧化氢酶活性促进效果表现较好，显著高于CK、T1、T2、T5，在黄瓜播种后15 d分别比CK、T1、T2、T5高137.50%、21.83%、15.12%、34.49%，而在黄瓜播种后30 d则分别高107.20%、47.42%、9.15%、60.03%；在黄瓜播种后15 d和30 d，T1、T2、T5幼苗叶片过氧化氢酶活性与CK之间均呈现显著性差异，以CK最低，分别为43.64 U·g-1·min-1和76.02 U·g-1·min-1，分别比T1、T2、T5低94.95%、106.31%、76.59%和40.56%、89.84%、29.48%。说明适量木霉菌剂处理对黄瓜幼苗叶片过氧化氢酶活性具有促进效果，进而有助于提高黄瓜幼苗对枯萎病的抗性。

2.2.2 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗叶片过氧化物酶活性的影响 如图5所示，在黄瓜播种后15 d和30 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片过氧化物酶活性均显著高于CK。在黄瓜播种后15 d和30 d，黄瓜幼苗叶片过氧化物酶活性随处理浓度增加呈先升高后降低趋势，且T3最高，分别为145.67 U·g-1·min-1和248.33 U·g-1·min-1；黄瓜播种后30 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜叶片过氧化物酶活性均比播种后15 d有所提高，随浓度增加，各处理的增加幅度分别为105.77%、61.65%、39.43%、70.47%、34.58%、73.34%。T3显著高于其他处理，在黄瓜播种后15 d分别比其他处理(CK、T1、T2、T4、T5)高278.72%、93.55%、15.33%、6.77%、137.41%，在黄瓜播种后30 d分别比其他处理(CK、T1、T2、T4、T5)高213.75%、104.12%、41.01%、35.25%、133.49%。其次，T4对叶片过氧化物酶活性促进效果表现较好，在黄瓜播种后15 d，T4显著高于CK、T1、T2、T5，分别高254.70%、81.27%、8.01%、122.35%；在黄瓜播种后30 d，T4与T2之间差异不显著，但二者均显著高于CK、T1、T5，T4分别高131.98%、50.92%、72.63%，T2分别高122.51%、44.76%、65.58%。在黄瓜播种后15 d和30 d，T1、T5幼苗叶片过氧化物酶活性与CK之间均呈现显著性差异，以CK最低，分别为38.46 U·g-1·min-1和79.15 U·g-1·min-1，分别比T1、T5低95.67%、59.52%和53.71%、34.38%。同样说明，适量木霉菌剂处理对黄瓜幼苗叶片过氧化物酶活性具有促进效果，有助于提高黄瓜幼苗对枯萎病的抗性。

图4 拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗过氧化氢酶活性的影响Fig.4 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on catalase activity of cucumber seedlings

图5 拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗过氧化物酶活性的影响Fig.5 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on peroxidase activity of cucumber seedlings

图6 拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗超氧化物歧化酶活性的影响Fig.6 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on superoxide dismutase of cucumber seedlings

2.2.3 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗叶片超氧化物歧化酶活性的影响 如图6所示，在黄瓜播种后15 d和30 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片超氧化物歧化酶活性均显著高于CK。在黄瓜播种后15 d和30 d，黄瓜幼苗叶片超氧化物歧化酶活性均随处理浓度增加呈先升高后降低趋势，且T3最高，分别为323.85 U·g-1和429.82 U·g-1。在黄瓜播种后15 d，T3显著高于其他处理，分别比其他处理(CK、T1、T2、T4、T5)高235.77%、82.44%、39.02%、19.29%、94.56%；T4显著高于CK、T1、T2、T5，分别高181.47%、52.94%、16.54%、63.10%；T2显著高于CK、T1、T5，分别高141.53%、31.23%、39.95%；T1与T5之间差异不显著，但二者均显著高于CK，分别高84.04%、72.58%；CK叶片超氧化物歧化酶活性最低，为96.45 U·g-1。在黄瓜播种后30 d，T3显著高于其他处理(CK、T1、T2、T4、T5)，分别高139.29%、36.86%、24.36%、17.29%、68.60%；T4与T2之间差异不显著，但二者均显著高于CK、T1、T5，T4分别高104.02%、16.69%、43.75%，T2分别高92.42%、10.05%、35.58%；T1、T5、CK之间均呈现显著性差异，以CK最低，为179.62 U·g-1，分别比T1、T5低74.84%、41.93%。同样说明，适量木霉菌剂处理对黄瓜幼苗叶片超氧化物歧化酶活性具有促进效果，进而提高了黄瓜幼苗对枯萎病的抗性。

2.2.4 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗叶片抗坏血酸过氧化物酶的影响 如图7所示，在黄瓜播种后15 d和30 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片抗坏血酸过氧化物酶均显著高于CK。在黄瓜播种后15 d和30 d，抗坏血酸过氧化物酶均随处理浓度增加呈先升高后降低趋势，且T3最高，分别为192.16 U·g-1·min-1和259.61 U·g-1·min-1。在黄瓜播种后15 d，T3与T4之间差异不显著，但二者均显著高于CK、T1、T2、T5，T3分别高107.45%、15.51%、10.70%、48.93%，T4分别高102.37%、12.68%、7.98%、45.28%；T2与T1之间差异不显著，但二者均显著高于CK、T5，T2分别高87.41%、34.54%，T1分别高79.60%、28.93%；T5较CK显著高39.30%；CK抗坏血酸过氧化物酶最低，为92.63 U·g-1·min-1。在黄瓜播种后30 d，T3显著高于其他处理(CK、T1、T2、T4、T5)，分别高97.53%、38.36%、17.12%、9.80%、63.73%；T4与T2之间差异不显著，但二者均显著高于CK、T1、T5，T4分别高79.90%、26.01%、49.12%，T2分别高68.65%、18.13%、39.79%；T1、T5、CK之间均呈现显著性差异，以CK最低，为131.43 U·g-1·min-1，分别比T1、T5低42.77%、20.64%。这也说明，适量木霉菌剂处理对黄瓜幼苗叶片抗坏血酸过氧化物酶具有促进效果，进而提高了黄瓜幼苗对枯萎病的抗性。

2.2.5 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗叶片多酚氧化酶活性的影响 如图8所示，在黄瓜播种后15 d和30 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片多酚氧化酶活性均显著高于CK。在黄瓜播种后15 d和30 d，多酚氧化酶活性均随处理浓度增加呈先升高后降低趋势，且T3最高，分别为3.72 U·g-1·min-1和5.61 U·g-1·min-1。在黄瓜播种后15 d和30 d，T3显著高于CK、T1、T2、T4、T5，分别高137.65%、22.22%、12.03%、8.67%、25.77%和101.15%、16.60%、12.53%、11.14%、17.72%；在黄瓜播种后15 d和30 d，T4与T2之间差异不显著，但二者均显著高于CK、T1、T5，T4、T2在黄瓜播种后15 d分别高118.70%、12.47%、15.74%和112.13%、9.09%、12.26%，T4、T2在黄瓜播种后30 d分别高80.98%、4.91%、5.92%和78.76%、3.62%、4.62%；在黄瓜播种后15 d和30 d，T1与T5之间差异不显著，但二者均显著高于CK，在黄瓜播种后15 d分别高94.45%、88.96%，在黄瓜播种后30 d分别高72.52%、70.86%；在黄瓜播种后15 d和30 d，CK均最低，分别为1.57 U·g-1·min-1和2.79 U·g-1·min-1。结果说明，适量木霉菌剂处理对黄瓜幼苗叶片多酚氧化酶活性具有促进效果，进而提高了黄瓜幼苗对枯萎病的抗性。

2.2.6 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜幼苗叶片生理指标的影响 表1表明，黄瓜播种后15 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片丙二醛含量、质膜透性均显著低于CK，T1、T2、T3、T4、T5丙二醛含量分别低29.70%、41.70%、60.82%、49.76%、21.94%，质膜透性分别低9.44%、34.46%、50.91%、36.61%、6.56%。T1、T5之间丙二醛含量差异不显著，但二者均显著高于T2、T3、T4，分别高20.59%、79.44%、39.93%和33.89%、99.23%、55.36%；T2、T4之间差异不显著，但二者均显著高于T3，分别高48.80%和28.24%；T3丙二醛含量最低，为10.41 μmol·g-1。T1、T5之间质膜透性差异不显著，但二者均显著高于T2、T3、T4，分别高38.18%、84.46%、42.87%和42.58%、90.33%、47.42%；T2、T4之间差异不显著，但二者均显著高于T3，分别高33.49%和29.11%；T3质膜透性最低，为37.65%。T3脯氨酸含量最高，为123.62 μg·g-1，显著高于CK、T1、T2、T4、T5，分别高70.18%、43.46%、31.16%、15.16%、48.58%；T4显著高于CK、T1、T2、T5，分别高47.78%、24.58%、13.90%、29.03%；T2显著高于CK、T1、T5，分别高29.75%、9.38%、13.28%；T1与T5之间差异不显著，但二者均显著高于CK，分别高18.63%、14.54%；CK脯氨酸含量最低，为72.64 μg·g-1。

黄瓜播种后30 d，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片丙二醛含量、质膜透性均比播种后15 d有所增高，且T1、T2、T3、T4、T5丙二醛含量、质膜透性均显著低于CK，丙二醛含量分别低34.84%、45.07%、60.28%、50.46%、27.35%，质膜透性分别低15.39%、29.30%、46.10%、32.86%、11.16%。T5丙二醛含量显著高于T1、T2、T3、T4，分别高11.49%、32.25%、82.88%、46.65%；T1著高于T2、T3、T4，分别高18.61%、64.03%、31.53%；T2、T4之间差异不显著，但二者均显著高于T3，高38.29%和24.71%；T3丙二醛含量最低，为15.54 μmol·g-1。

图7 拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗抗坏血酸过氧化物酶活性的影响Fig.7 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on ascorbate peroxidase activity of cucumber seedlings

图8 拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗多酚氧化酶活性的影响Fig.8 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on polyphenol oxidasea activity of cucumber seedlings

T1、T5之间质膜透性差异不显著，但二者均显著高于T2、T3、T4，分别高19.68%、56.96%、26.02%和25.67%、64.81%、32.32%；T2、T4之间差异不显著，但二者均显著高于T3，高31.15%和24.56%；T3质膜透性最低，为51.84%。在播种后30 d拟康氏木霉厚垣孢子菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片脯氨酸含量比播种后15 d有所增高，T3脯氨酸含量最高，为157.47 μg·g-1，显著高于CK、T1、T2、T4、T5，分别高70.39%、43.74%、32.93%、24.87%、47.86%；T4显著高于CK、T1、T2、T5，分别高36.45%、15.12%、6.46%、18.41%；T2显著高于CK、T1、T5，分别高28.18%、8.13%、11.23%；T1与T5之间差异不显著，但二者均显著高于CK，分别高18.53%和15.23%；CK脯氨酸含量最低，为92.42 μg·g-1。

综上可知，适量木霉菌剂处理可以降低黄瓜幼苗叶片中的丙二醛和质膜透性，提高脯氨酸含量以及CAT、POD、SOD、APX、PPO等酶活性，增强了抗氧化系统的功能，提高了黄瓜幼苗对枯萎病的防治效果。

表1 拟康氏木霉菌剂对黄瓜幼苗生理指标的影响Table 1 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on physiological indexes of cucumber seedlings

2.3 拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜枯萎病盆栽试验防治效果的影响

在黄瓜播种后15 d，调查拟康氏木霉厚垣孢子菌剂处理下的黄瓜幼苗的发病率、病情指数和防治效果，结果如表2所示。不同拟康氏木霉菌剂处理下的发病率和病情指数均显著低于CK，其中T3发病率和病情指数最低，分别为6.32%和8.27。T3与T4、T4与T2发病率差异均不显著；T1、T5发病率差异不显著但二者均显著高于T2、T3、T4，分别高126.56%、198.26%、152.68%和88.46%、148.10%、110.19%。T1、T5病情指数差异不显著但二者均显著高于T2、T3、T4，分别高45.06%、137.85%、61.36%和30.97%、114.75%、45.69%；T2、T4之间差异不显著但二者均显著高于T3，分别高63.97%和47.40%。T3防治效果最好，为83.98%；T3显著高于T1、T2、T4、T5，分别高35.69%、13.90%、9.95%、28.04%；T2与T4、T1与T5之间差异均不显著；T1防治效果最低，为61.89%。

3 讨 论

随着黄瓜规模化、基地化、专业化的不断发展和生态环境的变化，使得黄瓜病害问题十分突出，危害程度日趋严重，其中枯萎病是黄瓜生产中一种危害严重的土传真菌性病害[25]。长期以来，黄瓜枯萎病的防治主要依靠化学农药，化学农药的应用虽然取得了一定的效果，但其对人畜健康的影响以及对生态环境的危害日益严重并受到广泛关注[26]，生产出对人类身体健康有益、对环境友好的绿色无公害园产品是一项非常重要的任务。因此，制定对生态友好且高效的植物病害管理战略显得尤为必要[27]。

表2 拟康氏木霉菌剂对黄瓜枯萎病防效的影响Table 2 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents against cucumber Fusarium wilt

木霉作为广泛应用的植病生防真菌，对植物病原真菌有广谱的拮抗作用，如镰刀菌Fusariumspp.、腐霉菌Pythiumspp.、疫霉菌Phytophthoraspp.、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani等。利用生防木霉菌防治镰刀菌引起的植物土传病害已有较多的研究报道：如毕卉[28]利用绿色木霉Trichodermaviride的TV菌株对黄瓜枯萎病的防效为47.49%；长枝木霉Trichodermalongibrachiatum对黄瓜枯萎病的防效达到75.74%，而绿色木霉Trichodermaviride的防效为70.76%。本研究中的T3处理即施用105cfu·g-1拟康氏木霉菌剂，对枯萎病的防治效果最好，为83.98%；T3的病情指数则降为8.27，远远低于CK即不施用拟康氏木霉菌剂。

此外，木霉不仅能够防治植物病害，还对植物具有良好的促生作用，如张树武等[29]研究表明，深绿木霉发酵液对黑麦草幼苗的生长具有明显的促生作用，尤其是100倍稀释液处理的黑麦草幼苗根系长度、株高、鲜重、干重和根冠比的相对增长率分别为16.95%、13.33%、40.57%、73.68%和36.36%；赵玳琳等[30]研究发现，生防木霉GYXM-1p1菌株对甘蓝的促生作用最明显，处理后甘蓝植株的总鲜重和总干重分别较清水对照增加417.60%和762.69%。本研究中T3即105cfu·g-1拟康氏木霉厚垣孢子菌剂处理的株高、茎粗、叶面积、根体积、根冠比和壮苗指数均在各处理中为最高，分别为17.284 cm、4.241 mm、37.843 cm2、0.510 cm3、0.103、0.108，分别比CK高70.93%、50.76%、105.41%、200.00%、51.47%、68.75%，表现出拟康氏木霉处理对黄瓜幼苗的促生作用。这可能是因为木霉通过调节植物生理生化代谢过程，影响到植物的生长状态，起到了促进生长的作用[31]。

木霉菌与植物互作过程中木霉菌诱导植物分泌CAT、POD、APX、SOD、PPO、PAL(苯丙氨酸解氨酶)等次生代谢产物，影响MDA、质膜透性、Pro等生理物质含量，这些物质既能抑制病原菌也能诱导植物系统抗性[32]。前人的许多研究报道中均指出抗氧化酶和膜脂过氧化的主要产物均与植物的抗病性密切相关，如蔺泽荣等[33]研究表明，多孢木霉HZ-31菌株侵染藜后，POD活力、PAL活力、SOD活力一直高于对照组，分别增加46.44%、72.21%和8.12%。随着防御酶活性升高，植物防御能力也逐渐增强，CAT活力、PPO活力和MDA含量先升高后降低，说明藜受菌株HZ-31侵染后防御酶被激活，增强了对侵染的防御能力；王继雯等[34]研究表明，施加0.5 g·kg-1棘孢木霉SFC-3菌剂可以有效提高小麦叶片中SOD和POD活性，当施用量达1.0 g·kg-1时能显著降低MDA含量，当施用量为1.5 g·kg-1时对小麦孢囊线虫病的防效可达到88.68%；侯雪月等[35]利用哈茨木霉T8进行浸种和浇根处理，结果表明，T8组无论是叶鲜重、叶干重还是根鲜重、根干重、根长指标均显著高于同茬CK组，第3茬T8组芸芥的SOD、POD、PPO和脯氨酸含量分别比CK组高9.89%、130.00%、13.89%和59.05%，这或许与木霉诱导植物提高局部和系统抗性有关。本研究结果表明，在黄瓜播种后15 d和30 d，各浓度拟康氏木霉厚垣孢子菌剂均对黄瓜幼苗叶片CAT、POD、SOD、APX、PPO活性具有影响作用，且黄瓜播种后30 d的CAT、POD、SOD、APX、PPO活性均比播种后15 d有所提高。在黄瓜播种后30 d，T3的促进作用最强，CAT、POD、SOD、APX、PPO分别比CK提高了119.96%、213.75%、139.29%、97.53%、101.15%。同时，拟康氏木霉厚垣孢子菌剂均对黄瓜幼苗叶片MDA含量、质膜透性、Pro含量具有一定影响，在黄瓜播种后30 d，T3丙二醛含量和质膜透性最低，分别为15.536 μmol·g-1和51.842%，分别比CK低46.10%和60.28%；T3脯氨酸含量最高，为157.467 μg·g-1，比CK高70.38%。这些均与前人研究结果相类似，这可能是因为拟康氏木霉通过与黄瓜互作，诱导病原菌侵染条件下黄瓜植株产生CAT、POD、SOD、APX、PPO等保护性酶，清除了植物体内活性氧(ROS)[36]，降低了MDA含量，增加了Pro含量[37]，缓解了病害胁迫下膜脂过氧化作用对细胞膜的伤害，但本研究中仅对叶片中相关抗氧化指标进行了研究，在后续试验中，将对根系相关生理指标进行系统研究，进一步充实拟康氏木霉厚垣孢子菌剂对黄瓜生长的促生抗病机理。

4 结 论

拟康氏木霉886厚垣孢子菌剂通过提高黄瓜幼苗保护酶活性，改善了生理活性，促进了幼苗形态建成，增强了黄瓜对枯萎病的抗性。其中以T3即105cfu·g-1拟康氏木霉厚垣孢子菌剂应用效果最好，在黄瓜播种后30 d，黄瓜幼苗叶片中CAT、POD、SOD、APX、PPO分别比CK提高了119.96%、213.75%、139.29%、97.53%、101.15%，MDA含量、质膜透性分别比CK降低46.10%和60.28%，Pro含量比CK高70.38%。同时，T3处理黄瓜幼苗株高、茎粗、叶面积、根体积、根冠比和壮苗指数分别比CK高70.93%、50.76%、105.41%、200.00%、51.47%、68.75%，对黄瓜枯萎病的防效达到83.98%。