基于主成分分析和隶属函数的谷子全生育期耐旱性鉴定

2022-11-23肖继兵辛宗绪李俊志陈国秋朱晓东孙占祥

干旱地区农业研究 2022年6期

肖继兵，刘志，辛宗绪，李俊志，陈国秋，朱晓东，孙占祥

(1.辽宁省旱地农林研究所，辽宁朝阳 122000；2.辽宁省农业科学院，辽宁沈阳 110161)

干旱是限制全球生产的最重要的非生物因素之一[1]，其危害相当于其他自然灾害的总和[2-3]，严重影响植物正常生长发育，制约作物产量[4]。我国旱地面积占全国总土地面积的52.5%，每年因干旱损失的粮食达1亿t以上[5-6]。为了应对干旱威胁，对作物的耐旱性进行遗传改良是当务之急，而鉴定和评价作物种质资源的耐旱性是耐旱育种的前提条件[7]。我国谷子种植面积约100万hm2，占世界总面积的80%，在旱作农业生产和满足食物多元化消费中占有重要地位[8-9]。谷子是禾本科作物耐旱研究的新型模式作物[10-13],虽然耐旱性较强，但干旱仍然是影响其产量和品质的主要因素之一[14]。因此，谷子耐旱育种过程中，有必要对供试种质资源进行耐旱性鉴定。

多年来，国内外学者针对作物不同品种的耐旱性提出了多种鉴定方法[15-22]，并从形态[23-25]和生理生化[26-28]等方面的鉴定指标进行了研究。目前，对谷子耐旱性鉴定的研究主要是在谷子的萌芽期、苗期和全生育期，通过模拟不同程度水分胁迫，依据形态指标、生理生化指标和产量指标等，通过多元统计分析的方法对种质资源耐旱性进行综合评价和指标筛选[29-33]，苗期耐旱性鉴定是目前谷子种质资源耐旱性鉴定采用的主要方法[31-33]。张文英等[34]和刘婧等[35]研究认为根冠比、单穗粒重、灌浆期光合速率、蒸腾速率、株高、穗长可作为谷子全生育期耐旱性鉴定的指标，并用株高和穗长的耐旱系数和产量耐旱指数对谷子品种耐旱性进行了评价，认为谷子全生育期耐旱性鉴定结果相对更为可靠[35]。近年来相关耐旱基因和蛋白的研究能更确切地分析鉴定谷子的耐旱性[36-38]。谷子耐旱性评价和指标筛选过程中，为了避免单一指标的片面性和不稳定性，研究者们采用了主成分分析、隶属函数分析、聚类分析和逐步回归分析等相结合的方法进行多指标综合评价，而指标性状的耐旱系数和耐旱指数在评价体系中应用较为广泛[34-35,39-41]。然而任何评价方法都是对作物耐旱性实际结果的估计，不能代表其真正的耐旱能力。迄今为止，国内外对耐旱性鉴定指标和评价方法均没有准确可靠的统一规定，对作物耐旱性评价方法的研究仍未取得突破性进展。目前普遍认为，多指标多方法相结合的耐旱性综合评价相对更加真实可靠[42]，可以较好地揭示指标性状与耐旱性的关系。本文通过考量谷子相关农艺性状和产量指标的耐旱系数，建立谷子全生育期耐旱性评价的可靠方法和鉴定指标，以期为谷子耐旱种质资源鉴定及耐旱新品种选育提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2019—2020年在辽宁省旱地农林研究所示范基地进行(118°50′～121°20′E，40°35′～42°20′N)，属北温带大陆性季风气候，四季分明，昼夜温差大，年平均气温7.15℃，年平均日照时数2 800 h，10℃以上积温平均为3 220℃，无霜期150 d左右，年平均降水量438.9 mm，季节分布不均，70%～74%的降水集中在6—8月份，以雨养农业为主，一年一熟。供试土壤为砂壤质褐土，含有机质11.05 g·kg-1、全氮0.77 g·kg-1、碱解氮54.0 mg·kg-1、有效磷12.15 mg·kg-1、速效钾128.0 mg·kg-1、pH为7.6，田间持水量为19.5%。2019年和2020年谷子生育期降水量分别为341 mm和382 mm。

1.2 试验设计

试验设干旱胁迫(DS)和对照(CK)2种处理，每种处理30份谷子材料。采用随机不完全区组设计(alpha-格子设计)，各处理设3次重复，小区面积1.5 m2(1.5 m×1 m)，每个品种播种3行，行长1.5 m，行距25 cm，株距6.8 cm。播种前每区施高氮长效缓释复合肥(含N 26%、P2O512%、K2O 12%)600 kg·hm-2作为基肥，整个生育期不再追肥。干旱处理在移动式耐旱棚的干旱池内进行，播种前和定苗(5～6叶期)后分别灌水至田间持水量的70%，之后不再灌水，进行干旱胁迫处理；对照处理(非水分胁迫)在移动式耐旱棚外邻近地块进行，生长期间以自然降水为主，若遇严重干旱，适当灌水，保证谷子正常生长。供试谷子材料见表1。

试验期间不同处理土壤质量含水量(烘干法测定)见图1。2019年和2020年谷子抽穗期和成熟期，CK和DS处理各层次土壤水分t测验差异均达显著水平。2019年，DS处理抽穗期和成熟期0～20 cm土层土壤相对含水量分别为33.79%和31.69%，0～60 cm土层土壤相对含水量分别为48.21%和44.51%；2020年，DS处理抽穗期和成熟期0～20 cm土层土壤相对含水量分别为37.23%和29.02%，0～60 cm土层土壤相对含水量分别为41.64%和37.13%。一般认为当土壤相对含水量<40%时，作物受旱严重，土壤相对含水量为40%～60%时，作物呈现旱象[43]。2个处理土壤水分差异主要在抽穗期至成熟期，DS处理0～20 cm土层土壤含水量达重旱程度，说明谷子干旱胁迫处理有效。

表1 供试谷子材料Table 1 The tested foxtail millet materials

注：*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平差异显著。Note:* and ** indicates the significant difference at P<0.05 and P<0.01,respectively.图1 不同处理土壤水分Fig.1 Soil water of different treatments

1.3 测定项目与方法

农艺性状调查包括株高(PH)、倒二叶叶面积(LA)、主茎节数(SNN)、穗颈长(TNL)、茎叶干重(SLDW)、穗长(SL)、单株穗重(SWP)、穗粒数(KPS)、千粒重(TGW)、单株粒重(GWP)和小区产量(Y)，成熟后每小区中间行取样10株，参照谷子种质资源描述规范和数据标准进行，取2 a平均值作为供试性状测定值。

1.4 数据处理

耐旱系数采用式(1)计算[29]:

(1)

式中,DC为指标性状的耐旱系数；xi、CKi分别表示干旱、对照处理的性状测定值，n为指标性状数量；i为指标性状。

通过主成分分析计算各基因型谷子耐旱综合指标值。

F(Xj)=a1jX1j+a2jX2j+…+a1jXij
(i=1,2,…,n;j=1,2,…,n)

(2)

式中,F(Xj)为第j个综合指标值，aij表示各单一指标的特征值所对应的特征向量，Xij为各单一指标标准化处理值。

采用式(3)～(4)计算隶属函数值和耐旱性度量值[22,44]:

(3)

(4)

式中,u(xj)为各品种第j个综合指标的隶属函数值，xj表示第j个综合指标，xjmin和xjmax表示第j个综合指标的最小值和最大值；Pj为第j个综合指标贡献率，表示第j个综合指标在所有指标中的重要程度；D为耐旱性度量值。

采用SPSS 26.0进行配对样本t测验、主成分分析和相关分析，采用DPS 18.10进行联合方差分析和灰色关联度分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对谷子农艺性状和产量的影响

联合方差分析表明(表2)，土壤水分环境和基因型对农艺性状均有显著影响，而且土壤水分环境与基因型互作对谷子生长性状有显著影响，说明生长性状更易受环境变化的影响。干旱胁迫下，各指标性状值较CK均发生不同程度下降。t测验结果表明(表3)，处理间各性状成对数据差异均达到极显著水平(TGW除外)，其中SWP差异最大，其次为TNL。干旱胁迫处理和CK处理各性状变异系数分别为8.53%～43.32%(均值24.42%)和6.95%～48.36%(均值21.15%)，干旱胁迫处理各性状变异系数均大于对照(Y除外)。SNN和TGW的变异系数小于10%，说明二者在谷子材料间的离散程度较小。

2.2 各指标性状耐旱系数

从表4(见 39页)可以看出，供试谷子材料在干旱胁迫处理后，各性状平均耐旱系数均小于1。各指标性状耐旱系数平均值从大到小依次为TGW、SNN、SL、LA、PH、TNL、SLDW、SWP、KPS、GWP、Y。同一材料不同性状及不同材料同一性状耐旱系数均有较大差异，说明各指标性状对干旱胁迫反应的敏感性不同。由此可见，用任何单一指标的耐旱系数来评价品种的耐旱性都存在片面性和不稳定性，必须用多个指标进行综合评价才较为可靠。

表2 干旱胁迫和供水条件下不同基因型谷子农艺性状的联合方差分析Table 2 Combined analysis of variance for agronomic traits of different foxtail millet genotypes under drought stress and well-watered

表3 供试谷子材料形态和产量指标描述性分析Table 3 Descriptive analysis of morphology and yield indicators of foxtail millet

2.3 谷子种质资源耐旱性综合评价

前文已经分析，所选农艺性状指标对干旱胁迫反应的敏感性存在显著差异，说明各指标对谷子耐旱性评价的重要程度不同，需要用多指标进行综合分析。主成分分析方法能够通过线性变换从多元随机变量中提取相互独立的少数几个重要变量，重新组合成一组新的、互相无关的综合指标，并客观确定每个综合指标的权重。利用SPSS软件对30份谷子材料的11个鉴定指标的耐旱系数进行主成分分析。如果谷子耐旱评价指标之间没有相关性，则不能运用主成分分析法筛选出反映谷子耐旱能力的主要因子，因此本研究对所测定的各项农艺性状进行相关分析。由图2可见(见 40页)，各农艺性状指标间存在一定的相关性，有些指标相关系数达显著或极显著水平，其中株高、穗长、倒二叶叶面积和茎叶干重之间的耐旱系数极显著正相关，穗重、穗粒数、穗粒重和产量之间的耐旱系数极显著正相关，适合使用主成分分析。

表4 供试谷子材料各性状耐旱系数Table 4 Drought tolerance coefficient of each trait of foxtail millet genotypes

特征值在某种程度可看成是表示主成分影响力大小的指标，一般可用特征值>1及方差累计贡献率>80%作为主成分个数的提取原则。由表5可以看出，主成分分析将原来的11个评价指标转化为3个相互独立的综合指标，方差累计贡献率为81.269%。第一主成分相当于5.866个原始指标的作用，可以解释53.327%的方差，其中PH、LA、SLDW、SL、SWP、GWP指标载荷系数绝对值较大，说明这些指标可以较好地反映谷子的耐旱性，其中以SWP指标载荷绝对值最大；第二主成分主要反映的是TNL和KPS指标，相当于1.961个原始指标的作用，其中以TNL载荷绝对值最大；第三主成分中起主要作用的是SNN、TGW、Y指标，相当于1.113个原始指标的作用，其中以TGW载荷绝对值最大。3个主成分的因子权重分别为0.656、0.219、0.124。

利用各指标的耐旱系数(表4)和各主成分的特征向量(表5)，通过公式(2)可以分别求出每个谷子材料的3个综合指标值。在干旱胁迫下，同一综合指标数值越大，说明谷子耐旱性越强，反之越差。但谷子的耐旱性由这3个综合指标值共同决定，而且这3个综合指标在谷子耐旱性评价中的重要性不同。因此，利用公式(3)和(4)在综合指标基础上利用隶属函数计算各材料综合耐旱指标D值(表6，见41页)，其值越大，耐旱性越强。用D值作为标准来判别各参试材料耐旱能力的强弱，并对其进行排序。可以看出，G26的D值最高，耐旱能力最强，其次为G15和G30，G6的D值最低，耐旱能力最弱。

图2 谷子农艺性状耐旱系数相关分析Fig.2 Correlation analysis on drought tolerance coefficient of agronomic traits in foxtail millet

表5 供试谷子材料各指标主成分的特征向量及贡献率Table 5 Characteristic vectors of each index and contribution rate of principal components of foxtail millet

基于供试谷子材料D值，采用欧氏距离和非加权组平均法(UPGMA)对30份谷子材料耐旱性进行聚类分析(图3)。结果表明，参试30份谷子材料耐旱性可划分为5类，G1、G4、G14、G15、G17、G25、G26、G29、G30为Ⅰ类，属极强耐旱类型；G2、G3、G5、G9、G10、G13、G16、G21、G22、G23为Ⅱ类，属强耐旱类型；G7、G19、G24、G28为Ⅲ类，属中度耐旱类型；G8、G12、G18、G20、G27为Ⅳ类，属干旱敏感型；G6和G11为Ⅴ类，属干旱高度敏感型。

2.4 谷子种质资源耐旱指标筛选

由表7可以看出，各指标DC值与D值Pearson 相关分析和灰色关联度分析均表明，PH与D值关系最紧密，其次为SWP，TGW与D值相关联程度最小，同时各指标DC值与D值相关系数均达极显著水平(P<0.01)，TGW除外。

表6 供试谷子材料耐旱性综合评价Table 6 Comprehensive evaluation on drought tolerance of foxtail millet

图3 参试谷子材料D值的非加权组平均法聚类分析Fig.3 UPGMA clustering analysis of D value of foxtail millet

表7 供试谷子材料各指标DC值与D值相关分析和灰色关联度分析Table 7 Analysis of correlation and grey relation between DC and D values of each index of foxtail millet

为了确定供试谷子材料耐旱性鉴定首选指标，依据耐旱性聚类分析结果(图3)进行Fisher判别分析。结果表明，株高(PH)和单株穗重(SWP)对供试谷子材料耐旱性归类有显著影响(P<0.01)，判别函数如下：

YΙ=500.845PH+222.838SWP-286.540

YⅡ=456.282PH+185.898SWP-227.942

YⅢ=460.557PH+172.858SWP-224.291

YⅣ=398.277PH+163.884SWP-174.846

YⅤ=341.061PH+138.566SWP-127.905

3 讨论

3.1 谷子耐旱性鉴定方法

干旱胁迫是影响谷子生长发育的重要因素，对谷子进行耐旱性鉴定就是选用合适的评价方法和鉴定指标对不同基因型耐旱能力大小进行筛选、评价和归类的过程。植物生理学意义上的耐旱性是指植物对干旱胁迫的适应性和抵抗力，其耐旱能力的高低主要表现在产量方面。产量的高低是农业生产中作物耐旱性能最实用的表现[45]，因而有学者提出了以产量指标为依据的耐旱性直接评价方法[18-19,21,46-47]。这种评价方法能够简便、快速地对耐旱性进行大致的评判，但可能不利于从整体上把握作物耐旱的类型和机理，难以全面准确反映各材料的耐旱性强弱，而且也有研究认为仅依靠产量指标难以真正鉴定出作物的耐旱性[48]。作物的耐旱性是受多基因控制的复杂的数量性状，很难用单个指标进行鉴定，使用多指标评价更能从不同阶段、不同侧面反映作物耐旱性的强弱和特点，相应的产生多种评价方法。多指标结合多方法的综合评价结果更为合理可靠，可避免单一性状的片面性和不稳定性[19-20,40,49]。隶属函数法将作物的不同性状表现值，放在统一尺度下进行综合比较，使其具有可比性，可以反映多个构成成分的整体水平及综合特征，能够消除不同基因型谷子间固有的生物学和遗传学特性差异。

同一作物不同品种原有背景并不相同，因此，综合考虑作物在正常供水和干旱处理条件下的性状表现是鉴定作物耐旱性强弱的最有效方法。耐旱系数法是经典的耐旱性评价方法，为世界各国学者所认可，反映了干旱胁迫条件下作物农艺性状和产量的变幅，也就是对干旱胁迫的敏感程度，可有效消除不同谷子材料的遗传背景差异，是目前作物耐旱性鉴定用得最多的方法[50]。用耐旱系数法筛选的材料不一定具有较好的丰产性，但其可能蕴藏着耐旱基因，可为耐旱育种提供优异资源[47]，是一种简捷的度量基因型与环境互作的指标[34]。本文通过各指标性状耐旱系数主成分分析，较好地揭示了谷子耐旱相关性状与其耐旱性的关系，并确定耐旱性评价的各综合指标及相应的因子权重。通过选用反映谷子不同方面耐旱性的3个相互独立的综合指标并结合隶属函数求得谷子各材料耐旱性度量值D，以此作为谷子材料耐旱性强弱的判定标准，可以消除单纯依靠个别指标造成的结果片面性。林汉明等[51]认为，当多项指标综合评价获得的结果(如D值)符合连续变数的理论分布即正态分布时，可将结果划分为5级。本文D值为连续变数且符合正态分布，因此，依据D值通过聚类分析将供试谷子材料耐旱性分为5类，每类代表不同的耐旱级别。

3.2 谷子耐旱评价指标的筛选

联合方差分析表明，土壤水分环境对耐旱指标有显著影响，说明所选农艺性状指标可用于谷子耐旱性评价。基因型对各指标影响显著，表明所选谷子基因型丰富，适宜进行耐旱性鉴定。基因型与环境交互作用揭示了基因型在不同环境中相对表现的不稳定性，显示了基因型的尺度效应。本研究表明，基因型与土壤水环境的交互作用显著影响谷子的生长性状，但对产量性状的影响不显著(TGW除外)，即不同的土壤水分环境下，生长性状的稳定性低于产量性状，产量性状可能具有相对较强的耐旱性。

作物的耐旱性是环境胁迫与基因型互作的结果，最终通过各种性状在不同发育时期的一系列变化体现出来，不同指标性状对干旱胁迫的敏感性存在很大差异，因而指标性状的合理选择是耐旱性鉴定的关键。谷子耐旱性是在水分胁迫环境下，植物体内细胞在形态结构、生理生化上发生一系列适应性改变后，在植株形态和产量上的集中表现，是一个复杂的综合性状。一般来说，生长发育和产量指标是鉴定耐旱性的可靠指标。已有研究表明，谷子成株期以产量性状对干旱胁迫最为敏感，株高、单株穗重、单穗粒重和穗长等指标可作为谷子全生育期耐旱鉴定指标[34-35,40,52]。植株生长过程中对干旱所做出的反应表现为农艺性状的改变，本文以不同处理下测定的农艺性状和产量指标表现值为依据进行研究。结果表明，各耐旱评价指标平均耐旱系数均小于1，但有些材料个别指标的耐旱系数大于1(如G7的SNN，G9的SLDW，G15的TGW等)，说明干旱胁迫促进了这些指标性状的增加，这可能是由于不同种质材料抵抗干旱胁迫的能力不同所致。通过主成分分析可以看出，PH、SWP和GWP指标在第一主成分中载荷系数绝对值较大，与谷子耐旱性密切相关。通过判别分析确定PH和SWP可作为辽西地区谷子全生育期耐旱性鉴定首选指标，这与前人研究结果基本一致。干旱胁迫下的植株高度是该种群的主要特征，干旱胁迫最明显的影响之一就是植株高度降低[53-54]。这是由于干旱胁迫导致植株体内水分匮乏，必然影响到生理生化过程和器官建成，进而对生长发育造成伤害。植物生长迅速时(营养生长阶段)的水分胁迫首先限制了植物的株高[55]，降低了净光合速率，使植物的同化产物减少[56]，同时降低了结实率，进而减少穗粒数和单株穗重，不同程度影响谷子的形态建成和产量构成。株高是判断作物在干旱条件下能否正常生长的直观形态指标，可以作为耐旱性评价的可靠有力证据[55]，产量性状(如穗重等)是作物是否耐旱的最终表现。本研究提出的11个指标均为农艺性状指标，下一步需将形态、生理生化指标和耐旱功能基因及干旱诱导蛋白等鉴定指标综合考虑进行谷子全生育期耐旱性评价，进一步筛选经济、可靠的鉴定指标。