葫芦巴籽提取物对养殖水体水质和三角帆蚌抗氧化活性的影响

曾祥标，陈逸文，陈晓峰，刘仕军，白志毅，2，李文娟，2

(1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；3.上海牧高生物科技有限公司，上海 201306)

在大力发展优质、绿色、生态的水产养殖背景下，水产养殖的污染处理问题已经成为限制其发展的重要因素[1]。目前急需开发更多安全、清洁、高效的功能性产品，来缓解养殖水环境的压力，并同时增强水产动物机体免疫从而达到健康养殖的目的，这也是目前水产养殖的研究热点之一[2]。葫芦巴作为一种药用植物，其种子含有丰富的甾体皂苷和生物碱[3]，能够有效增强机体的抗氧化能力[4]。用添加葫芦巴籽提取物(fenugreek seed extract，FSE)的饲料喂养养殖动物能调节其肠道微生物菌群，通过增加有益菌总量从而减少动物粪便中氨气、甲烷等有害气体的排放[5]，而水体中有益菌的含量与水体中总磷的含量密切相关[6]，这为FSE在水体净化的应用提供了实验基础，但尚未有相关报道。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)俗称河蚌、珍珠蚌等，属双壳纲(Bivalvia)蚌科(Unionidae)帆蚌属(Hyriosis)，喜欢在水质清新的湖泊河流中生活[7]。三角帆蚌是我国生产淡水珍珠的主要育珠蚌，其珍珠产量占我国淡水珍珠的80%，占据重要的国际战略及经济地位[8]。目前我国养殖三角帆蚌培育淡水珍珠的方式多为施有机肥进行肥水养殖，这往往导致养殖水域水体的恶化，对三角帆蚌经济效益和机体健康产生了不利影响[9]。本实验研究了在养殖水体中添加FSE对水质的作用和对三角帆蚌抗氧化活性的影响，旨为FSE在净化养殖水体水质和三角帆蚌健康养殖两方面的应用提供基础数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

三角帆蚌采购于上海滨海生产基地，选取大小均一、喷水有力、体质健康的1龄蚌[长宽高分别为：(5.96±0.24) cm；(1.31±0.03) cm；(3.19±0.19) cm，体重：(17.49±0.96) g]，饲养于实验室玻璃缸内，以豆浆投喂并24 h不断充氧。养殖水体来源于实验室鲫鱼养殖水。养殖全程投喂鲫鱼配合饲料(通威股份有限公司)，每日早晚各投喂1次。FSE由上海牧高科技有限公司提供，成分分析见表1。

表1 FSE成分分析表

1.2 实验设计

采集1.1中的养殖水体，相同环境条件下，分别设5个FSE浓度处理组(0.02‰、0.04‰、0.06‰、0.08‰、0.10‰)和1个对照组(不添加FSE)，每组设3个平行。实验在玻璃缸(30 cm×30 cm×30 cm)中进行，养殖水体为10 L，全过程保持充氧，不换水，后采集水体样本分析其对养殖水体水质的影响。

根据FSE对养殖水体水质的影响，选择添加0.06‰浓度FSE进行进一步养殖实验。同样采集1.1中的养殖水体，以仅在该水体中放置三角帆蚌为对照组，以放置三角帆蚌并添加0.06‰浓度FSE为处理组，采集样品，分析水质指标和三角帆蚌血清的抗氧化活性。其中，每组设3个平行，每个平行放入10 L养殖水体和6只三角帆蚌。每个平行中取6个样品作为生物学重复进行测定。实验全程均在在玻璃缸(30 cm×30 cm×30 cm)中进行且保持充氧，不换水。

1.3 样品采集

1.4 测定方法

1.4.1 水质测定方法

1.4.2 三角帆蚌血清抗氧化活性测定方法

超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(ALP)采用碧云天公司试剂盒进行测定，丙二醛(MDA)采用索莱宝公司试剂盒进行测定，测定方法均参照试剂盒说明书。

1.5 数据分析方法

数据采用平均值±标准误(Mean±SE)表示，采用SPSS 17.0数据软件进行统计分析，使用单因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan法进行多重比较，P<0.05时表示差异显著。采用Excel和GraphPad Prism 8.0软件进行作图处理。

2 结果

2.1 不同浓度FSE对养殖水体的净化效果

添加FSE对养殖水体pH的影响如图1所示。在96 h时0.02‰浓度组pH显著低于对照组，其它时间点无显著性差异；而其它浓度组在24 h和48 h时pH显著低于对照组，在72 h和96 h时无显著性差异。

图1 不同浓度FSE处理对养殖水体中pH的影响

图2 不同浓度FSE处理对养殖水体中的影响

添加FSE对养殖水体中NO2-N含量的影响如图3所示。在72 h和96 h时，各浓度组NO2-N含量均显著低于对照组；在24 h时，0.08‰和0.10‰浓度组的NO2-N含量显著低于其他各浓度组；在48 h时，除0.02‰浓度组外，其余各浓度组的NO2-N含量均显著低于对照组。

图3 不同浓度FSE处理对养殖水体中NO2-N的影响

添加FSE对养殖水体中TN含量的影响如图4所示。在24 h时，0.08‰浓度组TN含量显著高于其它各浓度组。

图4 不同浓度FSE处理对养殖水体中TN的影响

添加FSE对养殖水体中TP含量的影响如图5所示。除在72 h时0.04‰浓度组与对照组的TP含量无显著性差异，其余时间点各浓度组TP含量与对照组相比均有显著性差异；0.08‰和0.10‰浓度组的TP含量始终显著高于对照组，而0.02‰浓度组TP含量始终显著低于对照组；在72 h和96 h时，0.06‰浓度组的TP含量最低。

图5 不同浓度FSE处理对养殖水体中TP的影响

添加FSE对养殖水体中PO4-P含量的影响如图6所示。在24 h和72 h时，0.08‰和0.10‰浓度组的PO4-P含量显著低于其它各浓度组。且随着时间的推进，各组水体中PO4-P的含量均呈现先升后降的趋势。0.10‰浓度组在96 h时的PO4-P含量降至最低。

图6 不同浓度FSE处理对养殖水体中PO4-P的影响

2.2 添加FSE对三角帆蚌养殖水体的净化效果

在养殖三角帆蚌水体中添加0.06‰FSE时，对养殖水体中pH以及PO4-P含量有显著影响，但对NO2-N含量无显著影响。如图7所示，在24 h时，处理组pH显著低于对照组，其余时间均无显著性差异。处理组PO4-P含量均低于对照组，且后者在48 h时的PO4-P含量较前者高出76.32%，差异显著。对照组和处理组NO2-N含量均呈现先升后降的趋势，但二者之间无显著性差异。

图7 三角帆蚌养殖添加FSE对养殖水体中pH、PO4-P、NO2-N的影响

图8 三角帆蚌养殖添加FSE对养殖水体中的影响

2.3 养殖水体中添加FSE对三角帆蚌抗氧化酶活性的影响

养殖水体中添加FSE对三角帆蚌机体SOD活性以及MDA含量均有显著影响，而对ALP活性无显著影响。如图9所示，对照组与处理组三角帆蚌SOD活性随测定时间呈现不同的规律，对照组SOD活性呈现下降的趋势，而处理组反之，且在48 h及96 h时，处理组SOD活性均显著高于对照组；MDA含量测定结果表明，随着时间的推移，处理组MDA含量呈现持续下降趋势，且在96 h时处理组MDA含量显著低于对照组；对照组和处理组各检测时间点及组间ALP活性均无显著性差异。

图9 添加FSE对三角帆蚌SOD活性、MDA含量、ALP活性的影响

3 讨论

3.1 FSE对养殖水体的净化作用

葫芦巴是一种在我国广泛生长的植物，其种子提取物具有降血糖和血脂、抗氧化、抗菌、抗肿瘤及增强免疫力等多种功效[11-12]。目前葫芦巴作为饲料添加剂已经广泛应用于畜牧生产业，具有广阔的前景，但在水产养殖领域的研究较少，在水质净化方面的研究尚未报道。

渔业养殖水质pH值一般控制在6.5～8.5之间，pH值过高或过低均会抑制水中的微生物活动，导致水体中有机物不易分解、自净能力减弱[13]。本研究结果表明，添加高浓度FSE在72 h之内有降低养殖水体pH的作用，在72 h和96 h时与对照组相比无显著性差异，初次添加FSE对养殖水体pH的作用时效为72 h左右。

氨氮作为水体最重要的环境污染因子之一，浓度过高时会对水生生物产生很强的毒害作用[14]。研究表明丝兰提取物可以显著降低水体中的氨氮含量[15]，而本研究结果显示FSE仅在24 h时显著降低了养殖水体中的氨氮含量。水体中氨氮含量与FSE添加浓度和取样时间均有密切联系，二者对氨氮作用的差异可能是其成分不同所导致。丝兰提取物含甾体皂苷类天然的表面活化剂、具有捕氨能力的多糖物质以及对氨基具有强烈结合能力的多酚物质，因此其具有很强的吸附作用[16]；而FSE主要成分为甾体皂苷、黄酮、葫芦巴碱等物质[17]，故二者对水中氨氮的吸收净化能力有所不同。

水体中的亚硝酸盐浓度过高会对生物体产生明显的毒害作用[18]。本研究结果表明，在72 h和96 h时各浓度组亚硝酸盐含量均显著低于对照组，其原因可能是FSE增加了水体中的有益菌数量，改变了水中微生物的稳态，从而降低了水体中亚硝酸盐的含量，但具体原因还有待进一步研究。磷是水生生物生长必需的营养元素，也是衡量水质好坏的关键因子，水体中磷循环是一个相当复杂的过程[19]。本研究结果表明添加高浓度的FSE能降低养殖水体中的磷酸盐含量却使总磷含量上升，但已有研究[19]发现水体中磷酸盐与总磷的变化趋势总是相似，这与本研究结果并不一致，其原因可能是高浓度的FSE能与水体中游离的磷酸根发生反应从而降低水中磷酸盐含量，而FSE本身含磷元素，加入水中导致总磷含量上升。

3.2 添加FSE对三角帆蚌养殖水体的净化效果

研究发现，养殖水体的水质是影响三角帆蚌生长和机体健康的重要因素，养殖水体中磷含量过高时往往会导致水体富营养化从而不利于三角帆蚌生长[20，21]。本研究结果表明向养殖三角帆蚌水体中添加FSE后总磷和磷酸盐含量显著下降，推测原因是FSE中的某些活性物质能加强三角帆蚌对藻类的滤食作用，具体调控机理仍需进一步研究。水体中总磷和磷酸盐的变化趋势分别为先降后升和先升后降，这与之前的报道并不类似，这可能与本研究所采用的实验动物有关。毛成责等[22]发现藻类总量的平均浓度与总磷呈显著正相关，暗示总磷含量的升高可能与蚌自身附着的藻类生长有关。本研究结果表明向养殖三角帆蚌水体中添加0.06‰浓度FSE并不影响亚硝酸盐、总氮、氨氮含量，不会对水环境产生不良影响，为今后FSE在三角帆蚌健康养殖中的推广奠定了一定的理论基础。

3.3 养殖水体中添加FSE对三角帆蚌抗氧化酶活性的影响

SOD对机体抗氧化活性以及免疫功能有重要调节作用，其活性的变化反映了机体抵制自由基损伤的能力[23]；MDA能反映机体潜在抗氧化能力，也能间接反映生物体细胞和组织过氧化后机体的损伤程度[24]；三角帆蚌缺乏特异性免疫反应，大多依靠体液免疫因子来清除异物，ALP是体液免疫因子中常被用做衡量蚌免疫活力高低的参照指标[25]。本研究选取以上指标来反映0.06‰浓度FSE对三角帆蚌抗氧化活性的影响。全碧波[26]发现葫芦巴提取物能显著提高大鼠肾组织过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性，从而增强其抗氧化能力以及免疫力，PRADEEP等[27]也证实葫芦巴种子具有增强老鼠免疫力的功能，GUARDIOLA等[28]证实向金头鲷投喂添加葫芦巴的饲料可增强其免疫应答。本研究也同样表明FSE能增强三角帆蚌SOD活性，提高三角帆蚌机体的相关免疫功能，这与前人的研究结果相同。血清MDA含量越低，表明机体细胞受损伤程度较小[24]。在96 h时，处理组MDA含量显著低于对照组。夏鑫等[29]发现喂食FSE后，断奶猪仔的MDA含量显著降低，其机体的抗氧化功能得到有效改善，张代等[30]发现肉鸡食用含葫芦巴的饲料后，MDA含量显著下降，均与本研究结果类似，说明添加FSE后三角帆蚌抗氧化能力有所增强。SUBRAMANIAN等[31]研究发现用添加葫芦巴碱的饲料喂养大鼠后其ALP活性显著降低，从而增强其抗炎及免疫能力，但本研究发现三角帆蚌养殖中添加FSE对蚌机体ALP活性并无显著影响，可能是由于研究动物自身种属差异性所致。三角帆蚌是无脊椎动物，为开放式循环系统，自身缺乏特异性免疫反应，相比脊椎动物更依赖于细胞防御[32]，但具体原因需要进一步研究探讨。