低剂量糖蜜添加对吉富罗非鱼养殖水质和微生物代谢多样性的影响

杨 泳，王新池，尹统统，宋 超,，孟顺龙，范立民

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏无锡 214081)

罗非鱼是我国主要经济鱼类，据统计，我国2020年淡水养殖罗非鱼产量约为166万t。在池塘养殖罗非鱼,养殖密度达17 400 kg/hm2时，每生产1 kg鱼需消耗水21 000 L[1-2]，产量的大量增长常伴随着养殖水环境的破坏。水产养殖发生水环境污染的原因主要是微生物、投喂饲料和水产品代谢产生的水体污染。在集约化水产养殖技术快速发展的当下，高密度养殖产生了大量代谢物及高蛋白饲料残饵沉积，极易引起养殖水质恶化，影响养殖生物正常的摄食、生长，甚至导致疾病和死亡[3]。

糖蜜作为制糖工业的副产品，具有易获取、成本低、用途广的特点。在水产养殖中，糖蜜常用在肥水、防病、降低溶解氮、促进动物生长等方面[10]，以实现水产健康养殖，因此其非常符合作为补充碳源的要求[11]。本实验利用Biolog-ECO法和检测常规水质理化指标的变化，分析研究低剂量糖蜜添加对养殖水体水质及水体微生物代谢多样性的影响，以期了解低剂量糖蜜添加对吉富罗非鱼养殖水体水质的影响，为日后低剂量糖蜜在水产养殖中的应用提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 实验设计

选用20个圆形聚乙烯养殖桶，容积为1 000 L。实验前养殖桶经过消毒后，加入约800 L自来水，使用增氧泵曝气7 d。曝气后加入约1 L塘底淤泥，提供微生物源。之后开始为期90 d的罗非鱼养殖，实验期间养殖水体温度控制在20～30 ℃，整个养殖周期不换水。养殖实验期间需保证供氧充足，每个养殖桶均插入两根输氧管，连接曝气石和增氧泵。实验期间养殖水体溶解氧浓度维持在(7.0±1.3) mg/L。

选取同批次、同等规格的吉富罗非鱼(GIFTOreochromisniloticus)，由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心屺亭基地提供，每个养殖桶放养20尾鱼苗，平均体质量为(3.89±1.33) g，养殖过程中进行相同频率的投喂，前期投喂量为体质量的1%，后期随着鱼体增长，调整为体质量的2%。按占投喂饲料质量的百分比设置4个不同的添加糖蜜梯度，分为对照组(C)、10%糖蜜实验组(10S)、20%糖蜜实验组(20S)和40%糖蜜实验组(40S)，每组处理设5个重复。前期养殖时间为60 d，待鱼体质量达到(10.00±0.13) g时(本实验中为7月31日)，开始添加投喂糖蜜。添加过程为先用适量养殖水溶解糖蜜，然后进行全桶均匀泼洒，添加时间与投喂饲料时间相同(09:00和16:00)。糖蜜添加量根据日投喂饲料量调整。基础饲料使用天邦食品股份有限公司产精养淡水鱼1号配合饲料。

1.2 样品采集与检测

1.2.1 水质检测

自7月31日起，每隔7 d从养殖桶水面以下30 cm处采集水样，检测水质指标包括pH、溶解氧(DO)、总氮(TN)、氨氮(NH3-N)、亚硝酸盐(NO2-N)、硝酸盐(NO3-N)、总磷(TP)和化学需氧量(CODMn)。采用钼酸铵分光光度法测定TP浓度，过硫酸钾消解紫外分光光度法测定TN，纳氏试剂分光光度法测定NH3-N，N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定NO3-N、NO2-N，高锰酸钾-草酸钠滴定法测CODMn质量浓度。pH及DO采用玻璃电极法测定[12]。

1.2.2 水体微生物代谢多样性检测

9月10日，用250 mL采样瓶取养殖桶水面下30 cm处养殖水体，沉淀2 h。沉淀完成后取上清液，用8孔加样器吸取150 μL加至Biolog-ECO微平板中，设置光照培养箱28 ℃恒温避光培养，每12 h使用Beckman Beachmark plus酶标仪(新振仪器设备有限公司，上海)读板一次，共读取14次Blank590和Blank750波长的数值，选择96 h的数据来分析不同样品中微生物对不同碳源利用效率的显著性差异，并进行微生物多样性指数及微生物群落主成分分析。

1.3 数据分析

读取Blank590和Blank750波长数值后，计算各实验组和对照组平均每孔颜色变化率(AWCD)，分析96 h时的数据，探究微生物对6大类碳源利用效率的显著性差异，进行主成分分析(PCA)并计算各样点的Shannon指数、McIntosh指数、Simpson优势度指数和丰富度指数。运用Microsoft office软件进行数据处理，用Graphpad Prism 9.0软件进行绘图。

AWCD、Shannon指数、McIntosh指数、Simpson优势度指数和丰富度指数计算公式如下：

AWCD=∑(Ci-R)/n

(1)

AWCD代表微生物群落利用碳源的整体能力。其中Ci为微平板31个碳源孔的吸光度值；R为对照孔的吸光度值；n为碳源的总数，在Biolog-ECO板中，n=31。

Shannon指数：H′=∑PilnPi

(2)

H′反映物种丰富度信息。Pi表示第i个孔的吸光度值与所有非对照孔吸光度值的比值(下同)。

Simpson指数：D=1-∑Pi

(3)

D表示优势度指数，衡量样本中优势种群信息。

(4)

U反映微生物群落均一性的变量。ni表示第i孔的相对吸光度值。

丰富度指数为被利用碳源的总数，即Ci-R的值大于0.25的孔个数。

2 结果与分析

2.1 低剂量糖蜜添加对吉富罗非鱼养殖水质的影响

7月31日首次投喂糖蜜后的两次采样中，实验组NH3-N浓度均高于对照组(图1-A)。8月24日后，实验组NH3-N浓度逐渐低于C组且40S组NH3-N浓度显著低于C组。此外，自9月7日采样起，各组NH3-N浓度随糖蜜投喂量增加而减少，特别是40S组与C组间有显著差异。

养殖过程中水体里TN、TP的含量同样呈现先上升后下降的趋势，整体看变化幅度不大。8月24日后(图1-B)，各实验组浓度开始低于对照组，但无显著差异。CODMn在养殖水体中的变化则是呈现先上升后稳定的趋势，并且糖蜜添加组含量始终高于C组。

图1 低剂量糖蜜添加对吉富罗非鱼养殖水质的影响

2.2 低剂量糖蜜添加对吉富罗非鱼养殖水体微生物代谢多样性影响

AWCD主要作用是通过一段时间内微平板孔内颜色的变化来反映微生物利用碳源的能力。由图2可知，不同浓度糖蜜投喂下养殖水体中的微生物对碳源整体的利用效率均随着培养时间的增加而增加。0～24 h区间内，微生物利用碳源程度较低，AWCD值上升缓慢，C组的微生物活性略高于糖蜜添加组的微生物活性。24～96 h区间内，各组微生物AWCD值快速上升，微生物利用碳源效率达到高峰。对不同组ECO微平板96 h AWCD值进行单因素方差分析发现，C组与各糖蜜添加组中的微生物AWCD值均无显著性差异。总体趋势上看，低剂量糖蜜添加组的微生物AWCD值变化幅度稍大于C组，不同组之间微生物AWCD大小排序为20S组>10S组>40S组>C组。表明低剂量糖蜜添加组中微生物对不同碳源的利用能力稍强一些。

图2 吉富罗非鱼养殖水体微生物对碳源利用情况

2.3 不同低剂量糖蜜添加下养殖水体微生物对不同碳源的利用效率

图3是在低剂量糖蜜投喂量的情况下，微生物对不同种类碳源的利用率情况。总体上，不同糖蜜投喂浓度下养殖水体微生物对6类不同碳源的利用效率随着时间的推移呈现上升趋势。对聚合糖类碳源的利用，在96 h后表现为缓慢下降的状态；对氨基酸类碳源，20S组与40S组108 h后明显高于C组及10S组；对酯类碳源的利用则是40S组明显高于低浓度糖蜜添加组及C组；对醇类碳源的利用效率整体最低，并且差异极小；对胺类及酸类碳源的利用强度则是10S组明显高于C、20S和40S组。整体上看，不同糖蜜添加组之间对醇类碳源利用效率最低，对氨基酸类、酯类碳源利用效率较高。10S组对胺类碳源的利用强度显著高于C组和其他糖蜜实验组。对其他各类碳源的利用，各组之间无显著性差异。

图3 不同浓度糖蜜下吉富罗非鱼养殖水体微生物对碳源利用

2.4 不同低剂量糖蜜添加下吉富罗非鱼养殖水体微生物多样性指数

微生物多样性指数包括Shannon指数、Simpson优势度指数、McIntosh指数和丰富度指数等组成。表1显示除10S和40S组的McIntosh指数较对照组显著升高以外，其他各实验组各指数均与对照组差异不显著。

表1 不同浓度糖蜜下吉富罗非鱼养殖水体微生物多样性指数

2.5 不同微生物群落对不同碳源的利用情况

为研究不同糖蜜投喂浓度下吉富罗非鱼养殖水体微生物群落碳代谢的影响，选取Biolog-ECO微平板培养96 h作为分析时间点进行主成分分析(PCA)，提取3个主成份，第一主成分(PC1)为48.74%，第二主成分(PC2)为23.93%，第三主成分(PC3)为12.17%，三个主成分综合了全部碳源84.84%的信息，提取前2个主成分作主成分分析图。其中两个主成分贡献率达72.67%。由图4-3可知C组主要分布在第I、IV象限，10S组主要分布在第I、II象限，20S组主要分布在第II象限，40S组主要分布在III、IV象限。10S组与20S组的三个点均在第II象限，说明两组之间相似度高。C组与各实验组之间距离较远，说明相似度不高，具有一定差异性。反映出低剂量糖蜜添加条件下养殖水体微生物群落有不同的群落结构，具有不同的碳代谢特点。

图4 不同微生物群落主成分分析

3 讨论

3.1 低剂量糖蜜添加对吉富罗非鱼养殖水质的影响

本研究结果显示，养殖过程中实验组与对照组一样水体里TN、TP的含量呈现先上升后下降的趋势，整体看变化幅度不大。但糖蜜投喂28 d后，各实验组浓度开始低于对照组，但实验组间无显著差异，显示出糖蜜对去除水体中TN、TP虽有一定的效果，但并不显著,这与汤佩武[19]利用生物絮团调控水质的研究结果相一致。本实验发现，对TN的去除率，随糖蜜投喂量的增加而增加。对TP的去除率则是20S组最好并且与对照组差异显著(P<0.05)，其他组间并未产生明显差异。TP的去除大部分是依靠水体中浮游植物消耗，随着糖蜜添加量的增加，养殖水体中浮游动植物数量也相应增加，最终TP浓度得到一定降低[20]。40S组并未与对照组产生明显差异的原因可能与投喂糖蜜后产生的大量异养菌对养殖水体中游离态磷的利用率不高有关[21]。

CODMn在养殖水体中的变化则是呈现先上升后稳定的趋势，并且糖蜜添加组含量始终高于对照组。CODMn含量的大小与水中有机和无机可氧化物质数量息息相关。各实验组CODMn含量均高于对照组的原因可能是投喂糖蜜后，糖蜜本身作为有机物添加后必然带来CODMn的升高。并且随着C/N升高，大量异养菌繁殖，与水体中残饵、原生动物等产生大量生物絮团，从而造成耗氧量的增加。但是过高的CODMn可能表明养殖水体中生物排泄物、残饵与浮游动植物残骸等颗粒悬浮物过多，养殖者需及时吸污排出以保证良好的养殖水环境[22]。

如今，越来越多的学者开始尝试用微生态制剂与糖蜜配合使用改善养殖水质。如张晓阳等[23]在凡纳滨对虾养殖中将芽孢杆菌与糖蜜配合使用，与仅使用糖蜜相比，产量提高了19.13%，饵料系数降低了22%。廖艺枢[24]通过实验研究了乳酸菌与糖蜜配合投喂对吉富罗非鱼生长性能的影响，发现其存活率、增重率显著高于对照组。未来，将糖蜜与其他微生态制剂配合使用处理养殖废水可能会成为一个发展方向。

3.2 低剂量糖蜜添加对吉富罗非鱼养殖水体微生物代谢多样性的影响

Blolog-ECO微平板法通过平均每孔颜色变化率数值的高低反映微生物群落利用31种碳源的整体偏好[25]。通过不同组数值之间的差异，可以深入分析各组间微生物群落的变化趋势，并且可以计算不同环境影响下微生物的多样性指数[26]。杨莺莺等[27]利用Biolog-ECO技术对池塘水环境的微生物群落进行分析，结果池塘水环境中微生物对氨基酸类、酸类和糖类碳源利用率较高。董媛媛等[28]通过在罗非鱼养殖中利用生物絮团进行饵料替代实验，发现养殖水体微生物对脂类和胺类碳源利用率较高，对酸类利用率最低。两人实验结果有很大不同，可能是因为实验环境的不同影响了微生物对碳源的利用。

在本次实验中，各实验组AWCD值平稳后数值均高于C组(图2)，表明实验组微生物群落对碳源利用水平高于C组。张哲等[29]通过实验发现，微生物群落结构随着添加碳源的变化也会发生一定的变化。根源在于不同的微生物对不同的碳源利用效率不同。因此加入不同的碳源会对微生物群落结构造成一定影响。本实验以糖蜜作为添加碳源，且实验全程温度适宜、pH稳定、溶解氧充足，微生物能够有良好的生长繁殖环境，最终各组数值产生一定差异，这与于皓等[30]的研究结果相吻合。进一步对本实验中微生物对六大类碳源的利用能力分析发现，最主要的利用碳源类型为氨基酸类和酯类，其次是酸类和聚合糖类，最后是醇类和胺类(图3)，这与杨莺莺等[27]的实验结论相吻合。

通过对各组进行微生物多样性指数分析，发现各实验组与对照组之间Shannon指数、Simpson指数和丰富度指数之间均无明显差异，而McIntosh指数，实验组显著高于对照组，说明实验组微生物多样性与对照组有明显差异。通过对各组养殖水体培养96 h时微生物碳源代谢进行主成分分析(PCA)发现各组散点图分布区域有一定差异，相关研究表明，不同条件下微生物群落有不一样的结构特点，因此产生了不同的碳源代谢特征[31]。这与本实验在不同浓度糖蜜投喂后散点图分布比较分散相吻合。 虽然单凭Biolog-ECO微平板技术很难完整地反映生态环境微生物多样性的变化规律，但通过运用BIolog-ECO技术对低剂量糖蜜投喂浓度条件下养殖水体的微生物群落进行分析，对运用低剂量糖蜜进行水产健康养殖仍具有一定借鉴意义[32]。

4 结论

本实验研究结果表明，低剂量糖蜜添加可有效降低吉富罗非鱼养殖水体水质中无机氮的浓度，并且随着糖蜜投喂量的增加，无机氮浓度降低趋势更加明显。糖蜜添加对TN和TP的去除也有一定效果。同时，投喂低剂量糖蜜明显增强了微生物对碳源的利用能力，微生物代谢能力增强，实验组微生物活性明显高于对照组。综合考虑成本等因素后，推荐20%糖蜜添加为适合的使用剂量。