COX-2和Ki-67表达与下咽癌临床病理参数的关系分析

刘 晨 刘 稳

下咽鳞状细胞癌发生率约占头颈部鳞状细胞癌的3%～5%[1]，多发生在梨状窝，其次为咽后壁，环后区较少，是一种相对少见的恶性肿瘤，多隐匿起病，明确诊断时多已为Ⅲ～Ⅳ期患者，且淋巴转移与远处转移率远高于其他头颈部恶性肿瘤[2-3]。尽管随着医学的进步，下咽鳞状细胞癌的治疗上有一定的进展，但因其发病隐匿、恶性程度高、易复发、易转移等特点，下咽鳞癌在头颈部恶性肿瘤中预后极差，5年生存率在25%～53%之间[4-5]。因此研究下咽癌的发病机理及寻找相关特异性分子标志物并明确新的治疗靶点，在改善下咽癌诊治策略，提高患者生存率方面具有重要意义。

环氧合酶(COX)是花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶。COX有两种同工酶COX-1和COX-2。COX-2由花生四烯酸转化而成，研究证实其与多种肿瘤的发生、发展以及侵袭和转移有密切关系[6]。

头颈部肿瘤发病过程中，细胞增殖周期起到非常重要的作用。Ki-67抗原是1983年由Gerdes等发现的在增殖细胞中表达的核抗原，是目前公认的细胞核增值标志物[7]。有研究表明，Ki67的表达能可靠迅速地反映多种恶性肿瘤增殖率，与其发展、转移等生物学行为有关[8-9]。

本研究采用免疫组织化学方法和Western-blot对下咽鳞癌组织进行COX-2和Ki-67检测，分析2种标志蛋白的表达与下咽鳞癌临床病理学特征及生物学行为的相关性，初步探讨COX-2和Ki-67作为评价下咽鳞癌发生发展中生物学行为的标志蛋白的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究纳入徐州医科大学附属医院耳鼻咽喉科2013年1月至2015年6月的下咽癌病例资料及手术标本共36例。所有肿瘤组织均经病理学确诊为鳞状细胞癌，并且术前均未行放疗、化疗。其中包括高分化癌32例，低分化癌4例，临床分期：T1、T2期共15例，T3、T4期共21例，有淋巴结转移23例，无淋巴结转移13例(有无淋巴结转移根据术后病理结果而定)。所有标本均经患者知情同意后手术切除获得，标本获取后分两部分保存：①经10%甲醛固定、常规石蜡包埋，4 μm厚度连续切片；②液氮冻存。

1.2 方法及试剂

1.2.1 免疫组织化学 采用免疫组化SP法。特异性一抗为兔抗人COX-2单克隆抗体(北京中杉金桥ZA-0515)和鼠抗人Ki-67单克隆抗体(北京中杉金桥TA500265)、SP试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。实验过程严格按说明书操作。标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，做成5 μm厚的组织切片,常规脱蜡水化，PBS冲洗3×5 min,置10 mmol柠檬酸缓冲液,用微波处理修复抗原、蒸馏水PBS各冲洗3×5 min。每张切片滴加50 μl第一抗体4 ℃ 孵育过夜，PBS冲洗3×5 min后甩去PBS液，每张切片滴加50 μl 工作浓度为1∶100 的生物素标记的第二抗体，室温下孵育10 min，PBS冲洗3×5 min后甩去PBS液，DAB显色、苏木精复染、脱水透明封片。PBS缓冲液代替一抗作阴性，用已知COX-2和Ki-67阳性的肺癌标本切片为阳性对照，以PBS液代替一抗为阴性对照。

免疫组化染色切片在高倍显微镜(200×)下观察，随机选择5个视野，以肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，计算每个视野COX-2和Ki-67阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。根据显色强度和范围，COX-2和Ki-67表达分为阴性(-)：<10%；弱阳性(+)：10%～50%之间；强阳性(++)：>50%。

1.2.2 Western-blot检测COX-2 将液氮中冻存的组织标本取出称重，每100 mg加入400 μl蛋白裂解液，置于匀浆器中反复研磨组织，使组织充分匀浆化，冰上充分裂解30 min，12000 r/min离心收集上清液，用BCA法测上清蛋白浓度。将蛋白置于12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转膜1.2 h,加入COX-2兔抗人多克隆抗体(1∶500)及β-actin小鼠抗人单克隆抗体(1∶1000)，4 ℃孵育过夜漂洗，加二抗(1∶2000)室温孵育1 h滴加发光试剂暗室曝光显示条带。

1.3 统计学处理

应用SPSS 20.0软件进行统计学处理，统计学处理采用卡方检验和Fisher确切概率法。检验标准P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学方法检测下咽癌组织中COX-2 和Ki-67蛋白的表达情况

2.1.1 COX-2和Ki-67在下咽鳞癌组织中高表达 COX-2在下咽鳞癌组织中，阳性细胞总表达率为77.8%，主要位于癌细胞浸润灶、下咽癌角化珠和坏死灶周围,棕黄色阳性颗粒弥漫分布于癌细胞的胞质或沿核膜周边呈线状分布,而且血管内皮细胞的胞质也有染色(表1)。Ki-67阳性总表达率为83.3%，阳性染色主要定位于下咽癌肿瘤细胞核，为棕黄色颗粒，呈弥漫性分布(表1)。

表1 COX-2表达和Ki-67表达情况比较(例，%)

2.1.2 不同临床分期下咽癌组织中COX-2和Ki-67的表达 在不同临床分期下咽鳞状细胞癌中，COX-2和Ki-67阳性率有统计学差异。与T1、T2期下咽鳞状细胞癌比较，T3、T4期癌组织中COX-2和Ki-67阳性率均明显增高，且有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 不同临床分期下咽癌组织中COX-2和Ki-67的表达(例，%)

2.1.3 COX-2和Ki-67表达与淋巴结转移的关系 COX-2和Ki-67阳性率与下咽鳞癌淋巴结转移有密切关系。有淋巴结转移的癌组织中COX-2和Ki-67阳性率均明显高于无淋巴结转移组织，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 COX-2和Ki-67表达与淋巴结转移的关系(例，%)

2.2 Western-blot检测下咽癌组织中COX-2蛋白表达水平

Western-blot检测结果显示：COX-2在下咽癌组织中表达水平明显高于下咽癌旁正常黏膜组织。两组比较差异有统计学意义(P<0.001)(图1、图2)。

注：图片取自72例样本Western-blot中的代表性结果；NC为癌旁正常组织；Ca为癌组织。

图2 下咽癌和癌旁正常组织中COX-2表达量

3 讨论

环氧合酶(COX)是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，其本质是一种膜结合蛋白，具有两种异构体形式，即COX-1和COX-2，其中COX-1在大多数组织中表达，并介导用于维持正常生理功能的肾上腺素；而多数组织在正常生理条件下并不能检测到COX-2的表达，但会因受到如炎症反应、生长因子、原癌基因和肿瘤促进剂等的刺激而迅速合成[10-11]，包括头颈部恶性肿瘤等各种癌症发病过程中将会表达上调[12-13]。COX-2主要通过抑制机体免疫功能 、抑制细胞凋亡,促进肿瘤组织血管形成、增加肿瘤的侵袭能力和促进癌前病变向肿瘤转化而参与癌的形成[14-15]。

Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，仅在细胞周期增殖阶段释放，标记着细胞增殖的状态[7]。有研究认为[8]，Ki-67在头颈部鳞状细胞癌的发病过程中能够作为放疗敏感性的预测指标，但不能作为化疗敏感性的预测指标。然而现有的研究结论尚不完全统一[16-19]，甚至有些矛盾之处，目前比较公认的是Ki-67的表达表明细胞处于增殖期而不能表明细胞增殖的速度[20-21]。因此进一步研究Ki-67与恶性肿瘤生物学行为之间的关系具有重要意义。

本研究表明：较高T分期的下咽癌或存在淋巴结的转移时，肿瘤组织中COX-2和Ki-67阳性细胞数增多，阳性率显著升高。癌组织中COX-2的表达量显著高于癌旁正常组织，表明COX-2和Ki-67在喉癌发生发展的生物学行为中可能起着重要的作用，可能促进癌组织的生长、增值及转移，这与二者在其他头颈部鳞状细胞癌相关研究中结论一致[22]。

综上所述，COX-2和Ki-67可能作为下咽鳞状细胞癌早期诊断及预后判断的分子指标之一，联合检测COX-2和Ki-67可能对判断下咽鳞癌的进展及预后有一定参考价值。