散瘀止痛续骨方通过Wnt3a/Lrp5信号通路促进肱骨骨折大鼠骨愈合

张永占，张宁，尚红涛，刘子豪，王燚炜

（1.秦皇岛市第一医院，河北秦皇岛 066600；2.衡水市人民医院，河北衡水 053000）

肱骨骨折是由车祸、挤压、手或肘部直接接触地面等直接或间接暴力所导致的一种骨科常见疾病[1]。该病致伤原因复杂，极易伴随血管及神经等损伤，且骨折愈合本身是一个复杂且相对漫长的生物学过程，临床常见骨折延迟愈合或不愈合[2]。因此，如何缩短骨折愈合时间、促进骨折愈合、减少骨折延迟愈合及不愈合等情况一直是骨科亟待解决的问题。中医学在加速促进骨折愈合方面具有独特的优势。中医学认为，骨折愈合是“瘀去、新生、骨合”循序渐进的过程，即“血不活则瘀不能去，瘀不去则骨不能接”[3-5]。本院自制散瘀止痛续骨方，具有散瘀、接骨、止痛的功效，临床治疗骨折取得了良好的疗效；但其具体作用机制尚不明确。已有研究发现，Wnt3a/低密度脂蛋白受体相关蛋白5（low density lipoprotein receptor-associated protein 5，Lrp5）信号通路在骨形成中发挥着重要的作用，其可通过促进成骨细胞形成、抑制破骨细胞骨吸收促进骨重建，有效改善骨损伤[6]。因此，本研究基于Wnt3a/Lrp5信号通路探讨散瘀止痛续骨方对肱骨骨折大鼠的治疗机制，以期为其临床应用治疗骨折提供实验基础，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只SPF级雄性SD大鼠，体质量200～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2020-0018。大鼠单笼喂养，12 h/12 h昼夜交替，在常温下无菌自由进食、饮水。适应性喂养2周后，按照《实验动物管理条例》进行实验。

1.2 药物、试剂与仪器 散瘀止痛续骨方由乳香8 g、没药8 g、地鳖虫10 g、赤芍15 g、川芎10 g、桂枝8 g、延胡索10 g、木香8 g、枳壳6 g、羌活6 g、防风6 g、骨碎补12 g、续断12 g、泽泻10 g、车前子8 g、白术10 g、熟地6 g、当归6 g、党参10 g、黄芪20 g、甘草6 g组成，所有中药材均购自秦皇岛市第一医院中药房。辛伐他汀片（北京伊塔生物科技有限公司，批号：YT1963）。生理盐水（北京伊塔生物科技有限公司，批号：YT3740）；苏木素染液（美国Sigma公司）；伊红染液（上海吉至生化科技有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）试剂盒（凯基生物科技发展有限公司）；Wnt3a抗体（艾美捷科技有限公司）；Lrp5抗体（武汉菲恩生物科技有限公司）；GAPDH抗体（美国Proteintech公司）。克氏针（河南泽垣医疗器械销售有限公司）；骨钳（南京卡尔文生物科技有限公司）；CX-60光学显微镜（日本Olympus公司）；KUBTEC XRAY-DXA双能X线骨密度仪[博卓生物科技（上海）有限公司]；KW-GU小动物骨骼强度测定仪（南京卡尔文生物科技有限公司）。

1.3 分组、造模与给药 将40只大鼠随机分为正常组、模型组、辛伐他汀组、散瘀止痛续骨方组，每组10只。模型组、辛伐他汀组、散瘀止痛续骨方组大鼠构建肱骨骨折模型。方法：麻醉大鼠后，将其仰卧位固定，消毒后充分暴露出肱骨骨干及肱骨内外髁，将1 mm克氏针逆行向上钻入肱骨髓腔，穿出皮肤后剪除多余针头尾端，用骨钳截断肱骨上1/3处以造成横行骨折。活力碘冲洗后在骨折周围滴入庆大霉素3滴，逐层缝合伤口，术毕给予肌肉注射50 mg/kg青霉素，连续3 d。正常组不做任何处理。建模成功后，散瘀止痛续骨方组给予灌胃1.5 mg·kg-1·d-1散瘀止痛续骨方水煎液（按中药常规煎煮方法），辛伐他汀组给予20.0 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃，正常组、模型组同期给予同体积生理盐水灌胃，每日1次，连续21 d。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 X线摄片 给药结束后，麻醉大鼠，固定，对患肢行X线摄片检查，观察大鼠骨折的愈合情况。

1.4.2 大鼠肱骨骨密度测定 应用双能X线骨密度仪测量肱骨整体骨密度（total bone mineral density，tBMD）、近端（近端上1/4）骨密度（proximal bone mineral density，pBMD）、中段（中1/2）骨密度（middle bone mineral density，mBMD）、远端（下1/4）骨密度（distal bone mineral density，dBMD）。

1.4.3 大鼠肱骨骨强度测定 应用小动物骨骼强度测定仪检测大鼠肱骨骨强度。

1.4.4 苏木素-伊红染色法观察大鼠肱骨组织病理形态 处死大鼠，迅速游离出肱骨，洗净后，进行脱钙、梯度乙醇脱水、二甲苯透明2次处理，然后进行石蜡包埋、切片。脱蜡后，进行常规HE染色，梯度乙醇及二甲苯脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察肱骨组织病理学改变。

1.4.5 Western Blot法检测大鼠肱骨组织中Wnt3a/Lrp5蛋白表达 取肱骨组织清洗、剪碎，加入放射免疫吸附分析（RIPA）裂解液研磨成匀浆，在冰上充分裂解10 min后，4℃离心取上清液，二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。沸水浴3 min并冷却后，进行电泳，再用半干法将凝胶上蛋白转移至甲醇活化的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。胎牛血清封闭2 h，分别加入稀释的Wnt3a、Lrp5、GAPDH等一抗（体积比1∶1 000）4℃摇床振荡孵育过夜。次日，PBS洗涤3次，加入稀释的二抗（体积比1∶5 000）室温孵育2 h，PBS洗涤3次，用增强化学发光（ECL）试剂显影，曝光。应用ImageJ软件分析灰度值，结果以目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值表示。

1.5 统计方法 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肱骨X线摄片结果比较 图1结果显示：与正常组比较，模型组可见明显骨折线，仅有少量骨痂生长且排列疏松；与模型组比较，辛伐他汀组、散瘀止痛续骨方组骨折线逐渐消失，骨痂明显增多且排列规则紧密，骨密度明显升高，且散瘀止痛续骨方组较辛伐他汀组改善明显。

图1 各组大鼠肱骨X线片表现Figure 1 X-ray findings of humerus in each group of rats

2.2 各组大鼠肱骨骨密度比较 表1结果显示：与正常组比较，模型组各段肱骨骨密度显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组、散瘀止痛续骨方组各段肱骨骨密度显著升高（P＜0.05），且散瘀止痛续骨方组升高作用优于辛伐他汀组（P＜0.05）。

表1 各组大鼠肱骨骨密度比较Table 1 Comparison of humeralbone mineraldensity among various groups of rats （±s，g·cm-2）

表1 各组大鼠肱骨骨密度比较Table 1 Comparison of humeralbone mineraldensity among various groups of rats （±s，g·cm-2）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与辛伐他汀组比较

组别正常组模型组辛伐他汀组散瘀止痛续骨方组F值P值鼠数/只10 10 10 10 tBMD 0.211±0.01 0.156±0.01①0.178±0.02①②0.199±0.02①②③12.300＜0.001 pBMD 0.213±0.02 0.154±0.01①0.176±0.01①②0.199±0.03①②③8.344＜0.001 mBMD 0.212±0.01 0.155±0.02①0.176±0.03①②0.198±0.01①②③8.061＜0.001 dBMD 0.211±0.03 0.155±0.02①0.177±0.02①②0.201±0.01①②③4.912＜0.001

2.3 各组大鼠肱骨骨强度比较 图2结果显示：与正常组比较，模型组肱骨骨强度显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组、散瘀止痛续骨方组肱骨骨强度均显著升高（P＜0.05），且散瘀止痛续骨方组升高作用优于辛伐他汀组（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肱骨骨强度比较（±s）Figure 2 Comparison of humeral bone strength among various groups of rats（±s）

2.4 各组大鼠肱骨骨折部位病理组织学特征比较 图3结果显示：正常组大鼠肱骨组织形态完整，骨小梁致密，骨髓腔大小正常，且可见成骨细胞；模型组骨组织形态遭到破坏，骨外膜内层明显增厚，出现明显充血现象，并可见大量炎性细胞浸润及少量纤维组织；辛伐他汀组、散瘀止痛续骨方组可见大量肉芽组织生长和新生毛细血管及软骨组织等，并出现大量骨痂及纤维组织，同时可见大量成骨细胞增生活跃，骨小梁间的空隙逐渐被新骨充满。

图3 各组大鼠肱骨骨折部位病理组织学特征比较（HE染色，×400）Figure 3 Comparison of histopathologicalcharacteristics of humeralfracture sites among various groups of rats（by HE staining，×400）

2.5 各组大鼠肱骨组织Wnt3a、Lrp5蛋白表达比较 图4结果显示：与正常组比较，模型组肱骨组织Wnt3a、Lrp5蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组、散瘀止痛续骨方组肱骨组织Wnt3a、Lrp5蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），且散瘀止痛续骨方组升高作用优于辛伐他汀组（P＜0.05）。

图4 各组大鼠肱骨组织Wnt3a、Lrp5蛋白表达比较Figure 4 Comparison of protein expression of Wnt3a，Lrp5 among various groups of rats

3 讨论

良好的血供是促使骨折愈合的首要条件[7-8]。本研究X线摄片结果显示，散瘀止痛续骨方组大鼠骨折线逐渐消失，骨痂明显增多且排列规则紧密。病理组织学特征结果显示，散瘀止痛续骨方组大鼠肱骨骨折部位新生大量肉芽组织、毛细血管及软骨组织，出现大量骨痂及纤维组织，同时可见大量成骨细胞增生，骨小梁间的空隙被新骨充满。表明散瘀止痛续骨方可显著促进骨折愈合，对肱骨骨折大鼠具有显著的疗效。提示散瘀止痛续骨方可能通过活血化瘀、通经活络、祛瘀生新等功效，起到扩张血管及促进血管生成的作用，进而有效改善血液循环、增强机体清除血肿的能力、增强血供，从而达到改善软组织损伤、抑制骨吸收，促进骨折的成骨等目的，最终有效促进骨折愈合。

骨密度及骨强度是反映骨质量及预测骨折危险性的2项重要指标，同时也与内环境的稳定性密切相关，其在判断及研究骨骼生理、病理及诊断全身各种疾病等方面均占有重要地位[9]。提高骨质量及骨的生物力学性能是骨折治疗的主要作用机制[10]。本研究结果表明，散瘀止痛续骨方可显著提高肱骨骨折大鼠骨密度及骨强度。提示散瘀止痛续骨方可能通过生新续损、接骨续筋等功效来促进骨吸收与骨形成之间的偶联作用，促进骨痂形成，进而有效促进骨形成及骨重建，并改善骨生物力学。

骨骼的生长、发育和代谢需要骨髓间充质干细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等相互协调作用，一旦其之间的动态平衡被破坏就会导致骨结构的异常，而骨折愈合过程就是恢复这一动态平衡的过程。孙欣欣[11]研究发现，Wnt3a/Lrp5信号传导通路能够通过调节成骨细胞增殖、分化两方面影响骨髓间充质干细胞向成骨细胞的转变，从而影响骨质的形成。有研究表明，Wnt3a可抑制骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化来参与骨形成[12-13]，而Lrp5可作为Wnt蛋白的跨膜受体通过促进成骨细胞功能来影响骨量的积累[14]。本研究结果显示，与模型组比较，散瘀止痛续骨方组肱骨组织Wnt3a、Lrp5蛋白表达显著升高，表明散瘀止痛续骨方可有效激活Wnt3a、Lrp5信号通路。提示散瘀止痛续骨方可能是通过激活Wnt3a、Lrp5信号通路，进而达到刺激骨细胞增殖分化、增加成骨细胞活性及胶原合成、抑制破骨细胞骨吸收、增加骨基质等的目的，从而促进骨折的愈合。

综上所述，散瘀止痛续骨方可有效地促进骨折大鼠骨愈合，其作用机制可能与激活Wnt3a/Lrp5信号通路有关，且疗效作用优于辛伐他汀。