柴胡加龙骨牡蛎汤对急性心肌梗死合并焦虑大鼠海马A型利钠肽及其受体的调节作用

王威，陈雅丽，张秀静，王帅，马迪，赵海滨

（1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

流行病学调查显示，约有52.5%的急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者在心肌梗死介入术后伴有焦虑[1-2]。冠心病事件及心源性猝死的发生风险随焦虑程度的提高而增加，且焦虑状态对AMI患者长期预后存在不良影响[3]。研究证实，焦虑过度激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，导致血小板聚集作用增强，冠状动脉痉挛、心肌缺血，加重AMI的发生[4]。而A型利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）能够抑制HPA轴活性，减少AMI的发生率，缓解患者的焦虑状态[5-6]。本研究在前期临床应用柴胡加龙骨牡蛎汤有效治疗AMI合并焦虑的基础[7-8]上，进一步探讨柴胡加龙骨牡蛎汤对AMI合并焦虑大鼠海马ANP及其受体水平的调节作用，以期为临床应用提供依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 18只SPF级健康6周龄雄性SD大鼠，体质量180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证编号：SCXK（京）2016-0006。动物饲养于北京中医药大学SPF级动物房，喂饲常规大鼠饲料及饮用水。本实验方案已经北京中医药大学实验动物伦理委员会审查通过。

1.2 药物、试剂与仪器 实验所用中药方剂源自《伤寒论》中的柴胡加龙骨牡蛎汤。具体成分如下：柴胡12 g、黄芩9 g、龙骨15 g、牡蛎15 g、党参9 g、桂枝9 g、茯苓15 g、半夏9 g、大黄9 g、珍珠母（代铅丹）15 g、生姜9 g、大枣10 g。实验使用中药颗粒剂，配方颗粒购自北京康仁堂药业有限公司。兔多抗ANP、兔多抗利尿钠肽A型受体（NPRA）（武汉三鹰生物技术有限公司）；兔多抗GAPDH（杭州贤至生物有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒（Q311-03，南京Vazyme公司）。小动物呼吸机（上海奥尔科特生物技术有限公司）；小动物超声影像系统（加拿大Visual Sonics公司）；标准规格酶标仪（美国Thermo Scientific公司，型号：Multiskan MK3）；自动洗板机（北京拓普分析仪器有限公司，型号：DEM-3）；离心机（美国Sigma公司，型号：3K18）；PCR仪（美国ABI公司，型号：9700）；荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司，型号：LC480II）。

1.3 建模 本实验依据前期造模研究[9]基础，采用不确定空瓶刺激法结合冠状动脉左前降支结扎建立AMI合并焦虑模型，即复合模型。

焦虑模型：参照文献及前期研究，采用不确定空瓶刺激法。建模周期21 d，建模期间大鼠自由摄食。第1～7天进行定时喂水训练，每日上午8∶00～8∶10和晚上20∶00～20∶10给予饮水，其他时段禁水让大鼠处于口渴状态。第8～21天进行空瓶应激，每日早晚随机选取一个饮水时间段给予空瓶，诱发其情绪应激，另一时间段给予喂水。

AMI模型：采用左冠状动脉前降支结扎法构建AMI模型。将大鼠称质量后用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，备皮，消毒，固定大鼠，气管插管，连接小动物呼吸机。沿大鼠胸骨旁左侧第3～4肋间方向切开皮肤，逐层分离皮下组织、肌肉，打开心包膜。用5.0缝合线，于心耳边缘下2 mm处结扎左冠状动脉前降支，进针深度控制在1 mm、宽度1～2 mm，收线打结。术中肉眼可见结扎线远端左室前外侧壁心肌变白区，逐层关闭胸腔。后移除呼吸机，轻捏大鼠胸廓，辅助其恢复呼吸。术后腹腔注射0.2 mL利多卡因防止心律失常、40万U青霉素预防术后感染。术中及术后大鼠苏醒前注意保暖。术后第2天行心电图，导联I、aVL、V1～V6中有6个及以上导联出现病理性Q波即为AMI模型构建成功。假手术组仅穿线后打松结，余步骤相同。

复合模型：即AMI合并焦虑模型，在不确定空瓶刺激建模的第15天对大鼠实行心肌梗死手术，继续给予空瓶刺激，至第21天造模完成。

1.4 分组与给药 分组：心肌梗死术后第2天根据心电图I、aVL、V1～V6导联中的病理性Q波进行区组随机分组。本实验共设计3组，将AMI成模大鼠分为AMI合并焦虑模型组（复合模型组）、柴胡加龙骨牡蛎汤组（中药组），另设假手术组，每组6只大鼠。

给药：根据本团队前期实验中药剂量筛选，中药组大鼠给药量按照成人（体质量60 kg）的6倍剂量折算，折合大鼠日生药剂量为13.6 g/kg，每剂中药颗粒用蒸馏水100 mL混匀。中药组大鼠心肌梗死术后第2天给予柴胡加龙骨牡蛎颗粒剂（10 mL/kg）灌胃，每日1次；假手术组和模型组术后第2天给予蒸馏水（10 mL/kg）灌胃，每日1次。至建模第22天处死动物，取海马组织。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 超声心动图检查 将大鼠称质量后用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定，左前胸大面积备皮，取左心室短轴切面，探测M型曲线，主要检测大鼠的左室收缩末内径（LVIDs）、左室舒张末内径（LVIDd）、左室短轴率（FS）、左室射血分数（EF）。每只大鼠取3个连续心动周期，取平均值。

1.5.2 旷场实验（OFT） 本实验采用体积为

100 cm×100 cm×40 cm的木制黑箱，底板画有25个正方形格子。在安静、弱光的环境下进行。先让大鼠适应性活动5 min，再将大鼠放在箱底中央格，开始计时并摄像，观察6 min内大鼠的活动情况。记录大鼠在敞箱内水平运动格子数、垂直运动次数以及中央停留区时间。

1.5.3 高架十字迷宫实验（EPM）该实验装置由两条相对开臂（50 cm×10 cm）和相对闭臂（50 cm×10 cm×40 cm）组成，中央有一开阔区（10 cm×10 cm），十字迷宫离地面50 cm。先让大鼠自由活动5 min，再将大鼠面向开放臂放入，开始计时并录像，观察5 min内大鼠在开臂和闭臂的活动情况，记录大鼠进入开臂次数（OE）和停留时间（OT），进入闭臂次数（CE）和停留时间（CT），计算OE/（OE＋CE）和OT/（OT＋CT）的比值。

1.5.4 采用尼氏染色法观察大鼠海马病理变化 大鼠麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，用灌流针自左心室插入，先后用生理盐水和4%多聚甲醛溶液灌流固定，摘取海马浸泡于组织固定液中，静置48 h后制备切片，观察海马尼氏染色情况。

1.5.5 RT-PCR法检测大鼠海马ANP及NPRA mRNA表达水平 将大鼠海马样本组织进行RNA提取，再将待测RNA逆转录成cDNA，逆转录完毕后加入90μL Nuclease-free H2O储存在-20℃冰箱备用。引物采用Roche LCPDS2软件设计并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。ANP上游引物序列为5’-CTTTCCTGAGAATGAACGTGT-3’，下游引物序列为5’-TCCTCCTCTTCTAGCAGATAGT-3’，扩增长度118 bp；NPRA上游引物序列为5’-TAT GGCAATGTGCTGACTGAA-3’，下游引物序列为5’-AGGCTGGAGCAAAGCTAAA-3’，扩增长度97 bp；ACTB上游引物序列为5’-GCGAGTACAACCTTCT TGC-3’，下游引物序列为5’-TATCGTCATCCATG GCGAAC-3’，扩增长度72 bp。利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒（Q311-03，Vazyme）在LightCycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪上进行反应。体系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，5μL；10μmol/L Forward primer，0.2μL；10μmol/L Reverse primer，0.2μL；cDNA，1μL；Nuclease-free H2O，3.6μL。PCR程序：95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，40个循环。循环结束后，采用2-△△CT法利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每1℃采集5次荧光信号。

1.5.6 Western Blot法检测大鼠海马ANP及NPRA蛋白表达情况 将海马组织充分裂解，离心取上清，BCA法检测蛋白浓度，取样品蛋白水浴10 min变性。加样后进行电泳1.5 h，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加ANP、NPR、GAPDH一抗4℃孵育过夜。次日，加二抗常温孵育2 h，滴加ECL试剂显色、曝光、定影，冲洗胶片。最后用BandScan软件分析胶片灰度值。结果以目的蛋白与内参蛋白GAPDH灰度值比值表示。

1.6 统计方法 数据均采用Excel表整理，采用SPSS 17.0统计分析软件进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示。将多组独立样本进行正态性检验和方差齐性检验，如方差齐则采用单因素方差分析，方差不齐采用独立样本秩和检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠超声心动图指标比较 图1结果显示：与假手术组比较，复合模型组左室EF及FS值明显下降（P＜0.01），LVIDs和LVIDd明显增加（P＜0.01）；与复合模型组比较，中药组左室EF及FS值升高（P＜0.01），LVIDs和LVIDd下降（P＜0.01）。表明AMI合并焦虑大鼠左心室功能降低，而柴胡加龙骨牡蛎汤对大鼠心功能有所改善。

图1 各组大鼠超声心动图指标比较Figure 1 Comparison of echocardiographic indices among various groups of rats

2.2 各组大鼠行为学指标比较 旷场实验结果如图2-A～B所示：与假手术组比较，复合模型组大鼠水平运动得分和垂直运动得分均显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与复合模型组比较，中药组大鼠水平运动得分和垂直运动得分有所上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。

高架十字迷宫实验结果如图2-C～D所示：与假手术组比较，复合模型组大鼠倾向于待在闭臂里，待在开臂的次数和时间比值均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与复合模型组比较，中药组的大鼠更倾向于待在开臂里，待在开臂的次数和时间比值均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明AMI合并焦虑可引起大鼠生理心理状态的改变，影响大鼠行为，柴胡加龙骨牡蛎汤可有效改善AMI合并焦虑大鼠的焦虑状态。

图2 各组大鼠行为学指标比较Figure 2 Comparison of behaviouralindicators among various gruops of rats

2.3 各组大鼠海马尼氏染色结果 图3结果显示：假手术组神经细胞排列紧密；与假手术组比较，复合模型组神经细胞排列松散，尼氏小体数量减少；与复合模型组比较，中药组尼氏小体数量明显增加。尼氏体是神经元内蛋白质合成的重要部位，当神经元受到刺激后，胞体内的尼氏体会明显减少。复合模型组大鼠尼氏小体数量明显减少，表明AMI合并焦虑可引起大鼠神经元结构改变，而柴胡加龙骨牡蛎汤可保护AMI合并焦虑大鼠海马的结构和功能。

图3 各组大鼠海马尼氏染色结果（×20）Figure 3 Results of Nissl’s staining in the hippocampus of various groups of rats（×20）

2.4 各组大鼠海马ANP及其受体mRNA相对表达量比较 图4结果显示：与假手术组比较，复合模型组ANP与NPRA mRNA相对表达量均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与复合模型组比较，中药组ANP与NPRA mRNA相对表达量均明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。ANP需与其相应受体结合才能发挥作用，ANP分泌增加，对维持心脏的基本生理功能具有重要意义，具有显著的心脏保护作用。结果表明，柴胡加龙骨牡蛎汤可提高AMI合并焦虑大鼠海马ANP及其受体的mRNA表达水平，从而发挥应激性心肌保护作用。

图4 各组大鼠海马ANP及NPRA mRNA相对表达量比较Figure 4 Comparison of the mRNA relative expression levels of ANP and NPRA in thehippocampus among various groups of rats

2.5 各组大鼠海马ANP及其受体蛋白表达量比较 考虑到ANP与其相应受体相结合才能发挥其正常的生物学作用，尤其是与NPRA的结合，因此，对海马组织中NPRA蛋白表达水平也进行了检测。图5结果显示：与假手术组比较，复合模型组ANP与NPRA蛋白相对表达量均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与复合模型组比较，中药组ANP与NPRA蛋白相对表达量均明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图5 各组大鼠海马ANP及NPRA蛋白表达比较Figure 5 Comparison of protein expression of ANP and NPRA in the hippocampus among various groups of rats

3 讨论

研究[10]证实，精神心理疾病是心血管疾病的独立危险因素，尤以焦虑与心血管疾病的关系最为密切。A型利钠肽（ANP）是一种具有生物学作用的肽类激素，需与利尿钠肽A型受体（NPRA）结合才能发挥其生物学效应，因此，NPRA的基因表达量和受体功能活性决定ANP生物效应。ANP主要在心房合成、储存并分泌入血。在脑组织中，ANP由特定的神经元合成与分泌，以下丘脑含量最高。因此，机体存在心脏和中枢2个独立的利钠肽系统，ANP不仅在心血管疾病过程中发挥着至关重要的作用，也能够有效地调节负面情绪，利钠肽系统失调可能成为焦虑发病的机制[11]。海马与人类学习、认知、记忆和控制机体情感等行为学功能密切相关，其作为应激影响的敏感部位，担负着HPA轴负反馈的高位调节中枢角色[12]。本实验海马病理结果显示，复合模型组大鼠尼氏小体数量较假手术组明显减少，表明AMI合并焦虑大鼠海马结构功能受损。这也证实ANP是一种具有抗焦虑作用的神经调节剂，海马ANP、NPRA激活后可抑制HPA轴活性，改善焦虑状态。

急性心肌梗死（AMI）属于中医学“胸痹”的范畴。张仲景《金匮要略》中就对胸痹进行了系统的阐述，说明其病机关键为心脉痹阻。焦虑属于中医学“郁病”的范畴，由于情志不畅，气机郁滞，以致心神不安，脏腑失调。《灵枢·本神篇》提出“心藏脉，脉舍神”，故心、神二者是一个有机的整体。朱丹溪《丹溪心法》云：“气血冲和，万病不生，一有怫郁，诸病生焉。”临床研究表明，心血管系统疾病患者存在明显的焦虑、抑郁等负性情绪，情志不畅，使气机紊乱，气血失调，易引发机体内环境变化，导致心血管疾病的发生、加速其发展[13-15]。作为心脏疾病的两个方面，将AMI（胸痹）和焦虑（郁病）作为一个整体来考虑，根据共同的病理因素用药物进行干预，同时兼顾心脏疾病及精神心理状况。本研究所选方剂柴胡加龙骨牡蛎汤来源于我国经典医学论著《伤寒论》，是在小柴胡汤去掉甘草的基础上加用龙骨、牡蛎、茯苓、桂枝、大黄而成，方中：主以柴胡疏表达里、调畅三焦、舒畅气血津液，加龙骨、牡蛎以镇肝胆之惊；取柴胡、黄芩为伍，解未尽之表邪，清泄少阳郁热，可使邪郁得透，气郁能达，火郁得清；大黄苦寒泄热，攻已陷之里热；桂枝温通经络，合大黄活血通络；茯苓、珍珠母宁心安神定志，半夏降逆化痰；党参、大枣、生姜补虚而安神，以培养其胃，调和诸药。本研究结果显示：与复合模型组比较，中药组海马尼氏小体增多，海马ANP及NPRA的mRNA、蛋白表达水平升高。表明柴胡加龙骨牡蛎汤可提高海马ANP、NPRA表达水平，有效改善AMI合并焦虑大鼠心功能及焦虑状态。

综上所述，柴胡加龙骨牡蛎汤可有效改善AMI合并焦虑大鼠心功能及焦虑状态，考虑其可能通过升高大鼠海马ANP、NPRA mRNA及蛋白表达水平，抑制HPA轴活性，从而减少AMI的发生率，缓解焦虑状态。