蜜蜂分子标记研究进展

王 哲，陈文凤，王红芳，胥保华，刘振国

（山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018）

1 分子标记的概念及研究意义

分子标记（Molecular markers）是指可遗传的、能被定位和识别的DNA序列（广义的分子标记还包括蛋白质等生物物质），是DNA水平遗传多态性的直观映射。目前分子标记已被广泛应用于各种生物领域，利用分子标记技术可在分子水平检测生物体之间的差异，有着准确度高、特异性强、重复性好、易检测、微量且高效的优点[1]，是一类非常实用的技术。随着分子生物技术的快速发展和不断提升，人们对生物基因组结构、物种进化的认识不断深入[2]，极大地促进了分子标记的研究，为深入开展分子标记选择提供素材。

根据实际需求选择合适的分子标记，优秀的分子标记应具备重复性好、检测方法简洁快速、多态性好等特征。本文总结了近年来国内外分子标记在蜜蜂上的应用及研究进展，力求为未来蜜蜂分子标记的研究提供借鉴。

2 分子标记的研究技术手段

在蜜蜂中常应用的分子标记技术主要有限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphisms，RFLP）、随机扩增多态性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、重复简单序列（simple sequence repeats，SSR）、单核核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP） 和 线 粒 体DNA标记（mitochondrial DNA，mtDNA）等。以下主要简单介绍这5种分子标记：

2.1 RFLP

RFLP基于分子杂交，是最早的一代分子标记技术，常应用于鉴别品种、检测物种不同环境下的进化水平，其基本原理是利用限制性核酸内切酶酶切生物体的DNA，用凝胶电泳分离DNA，用Southern blots手段分析结果多样性[3]。RFLP的优点在于筛选隐性基因，无表型效应，且标记之间不会互相干扰，结果稳定可靠。但RFLP每次只能检测一个位点，操作复杂，致使工作量较大[4]。

2.2 RAPD

RAPD基于PCR技术，通过PCR用同一引物进行随意扩增，对扩增片段进行多态性分析。RAPD有着操作简单、所需DNA含量较少、引物通用性强的优点[5]，因此被广泛应用，如制作遗传图谱、检验外源基因和纯度鉴定等[6]。但RAPD无法判断显性隐性遗传，对PCR的条件非常严格，因此标记重复性不高。

2.3 SSR

SSR也称微卫星DNA，基于PCR技术。SSR一般是100～200 bp的短序列且以1～6个核苷酸为重复单位[7]。SSR具有多态性，但其两侧序列相对保守，因此可设计特异性引物进行PCR扩增，最终分析扩增所得的DNA片段电泳结果的多态性[8,9]。SSR标记具有多态性高、共显性、结果稳定和操作简捷快速等优点被广泛应用到品种鉴定、亲属关系分析、群体遗传学等领域[10,11]，因此，SSR是目前最常用的微卫星标记之一。

2.4 SNP

SNP基于DNA序列，指的是因生物基因组上某个位点上单个碱基的变化（碱基对的插入、缺失、转换等）而引起的多态性[12]。SNP的分析技术有很多种，根据研究对象分类可分为寻找SNP与某遗传性状的关系和对不同群体已知SNP进行遗传多样性检测或诊断已知致病基因2种[13]。鉴于SNP分布广，具有代表性的优点，SNP已成为最有前景的分子标记之一[14]。随着DNA测序技术的发展，SNP技术快速发展，已实现高通量、自动化检测。

2.5 mtDNA

线粒体是细胞中能量代谢的细胞器，其中含有少量的DNA，这部分遗传物质较为保守、分子结构简单、无组织特异性[15,16]，是进行遗传分析的优秀素材。mtDNA还具有母系遗传的特点，而在同一蜂群中的工蜂具有相同的母系，所以mtDNA在蜜蜂遗传研究上具有很大的优势。

3 分子标记在蜜蜂研究中的进展及应用

3.1 种类鉴别及地区内的生物多样性分析

分子标记被大量地运用在种类鉴别上，利用不同分子标记的优点可具体至亚种之间。不同亚种之间的生物学特性和农业特性不同，而多样性的增加无疑对蜜蜂及环境是有益的。

Mikhail等[17]为了鉴定俄罗斯境内的不同蜜蜂亚种，分析了COX1基因的Folmer区域，确定了亚种特有的SNPs，建立了利用诱变引物进行RFLP的方法用于确定这种蜜蜂亚种，这种方法快速、易行。Samina等[18]利用RAPD技术对巴基斯坦Nankana和Narowal 2个地区的5个不同采集地点的蜜蜂进行变异和迁移率的分析，结果显示两地区的基因组存在差异，群体内的遗传多样性增加，在此基础上可以进一步研究其他寄生虫和病原体对多样性的影响以及这些状况对蜂群的影响。为保护本地西方蜜蜂资源，Parejo等[19]采集了瑞士几个地区的雄蜂的全基因组序列信息，分析了当地的种群结构和遗传多样性，评估了本地蜜蜂的基因深入程度，结果显示50个SNP就足以区分本地和引入蜜蜂，且各地区皆有混合个体，管理工作需要加强，由此可见SNP是进行此类工作中准确有效的工具。

3.2 蜂王浆高产群体的筛选

蜂王浆是工蜂头部咽下腺及上颚腺共同分泌的液体物质，时至今日，对于蜂王浆的生理功能已经有很多研究，是公认的绿色保健品。如何提高蜂王浆的品质和质量一直是大家关注的重点问题，利用分子标记，可以快速筛选到高产量群体。

曹联飞等[20]人利用5个微卫星位点和2段线粒体DNA序列，对3年浙江平湖地区的浆蜂群体进行遗传分析，为浆蜂资源保护提供科学依据，结果显示该地区浆蜂群体的线粒体单倍型单一化逐年明显，提醒我们应及时采取必要保护措施，加强监管力度。自1956年意大利蜜蜂引入巴西后迅速繁殖，为提高蜂王浆的产量，开始了蜜蜂蜂王选育工作，Ana Paula等[21]利用RFLP和mtDNA的技术手段评估了不同MRJP3微卫星标记的多态性，最终发现6个等位基因，利用这些等位基因判断蜂群蜂王的基因型，继而从中选出在生产蜂王浆上有优势的蜂王并确定蜂王的遗传来源，验证育种效率。

3.3 抗逆、抗病群体筛选

在蜂群中存在着微孢子虫病、白垩病、螨虫等常见的蜂群病，它们严重影响着蜂群的生存繁衍。传统的蜂药耗费人力、效果差且会对蜜蜂产生其他消极影响，所以筛选出抗病的优秀蜂种对蜂业的发展尤为重要。

Ostroverkhova等[22]研究了几种微卫星位点变异与微孢子虫病的关系，并筛选出AC117位点的等位基因“177”、Ap243位点的“263”和SV185的“269”3个遗传标记可用于鉴定意大利蜜蜂的微孢子病抗性，但是亚种之间在基因位点上的差异还未解决，需要进一步的研究将不同蜜蜂亚种考虑进诊断标记物的特异性。聂红毅等[23]对人工饲养的意大利蜜蜂幼虫进行蜜蜂球囊菌的接种，以筛选抗病和不抗病的蜜蜂个体，而后发现了第十一号染色体LOC100578413染色体的非编码区的SNP（T14570310C）与抗白垩病相关，可为我们检测蜂群白垩病和筛选抗白垩病蜂种有重要意义。吴黎明等[24]以卡尼鄂拉蜂、高加索蜂和平湖意蜂为素材，建立了3个纯系，以RAPD为工具分析找出与抗螨、高产能力相应的基因片段，在此基础上选育出“HYR”和“JYR”2个高产、可稳定遗传的抗螨杂交蜂种。

3.4 行为相关的基因筛选

在蜂群中，蜂王、工蜂、雄蜂有着明确的分工，工蜂之间同样有着明确分工。对于意大利蜜蜂而言，在2～3周之前的工蜂常担任巢内的清洁哺育工作，其他蜜蜂负责采集花粉花蜜，而蜜蜂行为的调控除了受到环境、激素的调控外，还会受到基因的调控。

Hunt等[25]利用RAPD和其他工具确定了2个基因座（pln1和pln2、LOD3.1和LOD2.3）与蜂群的采集行为相关，2个基因座的等位基因对觅食行为有不同影响，pln1和pln2都对蜂群的采集花粉量相关，pln2相关的标记的替代等位基因的个体在采集花蜜的浓度上存在差异。对于行为等复杂特征的研究，确定定量性状位点（QTL）是比较困难的，Rueppell等[26]结合蜜蜂基因组、SNP、AFLP、SSR和已被确定与蜜蜂初次觅食年龄的QTL，最终确定了2个QTL及其位置，提示第十一号染色体上的1个新的基因组区域影响首次觅食的年龄，并进一步确定了Ank2、PKC、Erk7和amontillado在复杂社会特征“首次觅食的年龄”自然行上的功能。

4 分子标记在蜜蜂研究中的展望

分子标记是在遗传标记研究过程中被发现的一种趋向微观、较准确的标记，被应用在研究各类生物的遗传图谱建立、种类鉴定、选种育种等方面。虽然分子标记出现的时间不长，但发展迅速，分子标记也在向更简便、更准确的方向发展。随着各类生物基因库的建立，分子标记的开发必定更加多样，应用更加广泛，如新兴的分子标记手段：基于内含子扩增多态性（IBAP）、基于外显子扩增多态性（EBAP）等。虽然分子标记是一种刚刚发展起来的技术手段，但从其他植物、微生物、动物、昆虫上看，分子标记已显露出它独有的优越性，在蜜蜂方面的研究仍有很大的发展空间。

蜜蜂是重要的传粉昆虫，具有重要的社会价值和生态价值。蜜蜂隶属于蜜蜂科、蜜蜂属，目前世界上公认的有9种，具体又可分为不同亚种，在形态结构、生产性能和抗病性能等方面各具特色，是宝贵的育种素材。蜜蜂面临复杂多变的生态环境，受到多种生物和非生物胁迫。因此，选择繁育具有高抗逆抗病、高产浆性状的群体是必要的，在筛选出拥有优良性状的群体后，物种的保留和延续也是我们应当关注的方向。筛选特定形状的分子标记是开展蜜蜂品种培育和配套系组合的有效途径，蜜蜂全基因组的建立和高效的测序技术都为我们提供了技术基础。广泛学习不同的分子标记方法，与时俱进，灵活地把各种分子标记技术结合利用在蜜蜂的基因研究、特定性状选育、适应性进化、蜜蜂保种、肠道微生物功能等领域也是未来可以努力的方向。