上皮间充质转化介导慢性阻塞性肺疾病的研究进展*

张庆柳 综述，赵 伟，管思彬 审校

(同济大学附属东方医院心衰专科，上海 200120)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以持续性气流受限为特征的常见慢性气道炎症性疾病，具有很高的致死、致残率，已成为严重的全球性公共卫生问题[1]。流行病学调查显示，2017年我国COPD现患人群约1亿，COPD已成为我国第四大致死疾病，给患者家庭和社会均带来了沉重的经济负担[2]。

气道重塑是COPD的重要病理生理改变，主要发生在直径小于2 mm的小气道内，表现为气道和肺对有害颗粒和气体炎性反应增加，异常修复与损伤持续进行，上皮杯状细胞增生，基底膜增厚，胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积增加，最终导致小气道纤维化、气道狭窄、阻力增加。虽然目前的药物治疗、肺康复治疗及外科肺减容手术等临床治疗手段在一定程度上可改善患者症状，但难以逆转气道重塑的进展。近年来，有研究表明，上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在COPD气道重塑的发生、发展中扮演重要角色[3]；深入研究EMT在COPD气道重塑中的特征和机制，寻找潜在干预靶点已成为研究热点。

1 EMT概念

EMT是指上皮细胞在生理和(或)病理条件下经历多种生物化学改变最终获得间质细胞特性的过程，表现为细胞紧密连接和黏附性下降或消失，细胞极性丢失，迁移和运动能力增强，获得穿透基底膜的潜能，侵袭进入固有层[4]。在EMT过程中，上皮细胞标志物——E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、紧密连接蛋白1(zonula occludens，ZO-1)等表达降低，同时间质标志物表达增加，包括α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白、N-钙黏蛋白(N-cadherin，N-cad)、纤维连接蛋白(fbronectin,FN)等[5]。

根据发生的背景及生物学行为和标志物的不同，EMT可分为3型，Ⅰ型EMT主要与胚胎发育和器官形成相关；Ⅱ型EMT主要参与创伤愈合、组织再生和器官纤维化过程；Ⅲ型EMT与异常增强的血管发生有关，参与上皮细胞来源的恶性肿瘤侵袭和转移。这3种类型EMT的转归是相同的，即上皮细胞发生极化，获得间质细胞的特性。但与Ⅰ、Ⅲ型EMT明显不同的是，Ⅱ型EMT的始动因素主要是炎症和损伤[6]。在持续性炎症和损伤作用下上皮细胞失去E-cad等标志物，脱离黏膜层，进入受损基底膜并迁移至间质组织，获得间质细胞表型，分泌大量ECM，导致纤维化的发生。

2 EMT参与COPD的气道重塑

香烟烟雾等有害气体/颗粒引发气道氧化应激和持续性炎症，诱导气道上皮组织屏障功能下降并发生EMT[7]，向成纤维细胞/肌成纤维细胞分化。转分化的上皮细胞间黏附力下降，细胞骨架蛋白构成改变、迁移能力增加，进一步激活相关信号通路，引发ECM过度沉积，上皮周围纤维化，加剧COPD小气道内实质结构的破坏和气流受限，最终导致气道重塑进行性发展[8]。

MILARA等[9]通过分离了COPD患者小气道原代细胞，并与对照组比较，结果显示，上皮细胞标志物——E-cad、ZO-1、细胞角蛋白5表达均明显降低，而间质标志物——α-SMA、波形蛋白、CollagenⅠ表达均明显增高。有研究也发现，COPD大鼠气道纤维化程度明显增高，E-cad表达降低，α-SMA表达增加[10]。进一步体外研究证实，在香烟烟雾刺激下，鹅卵石状排列的支气管上皮细胞分化为梭样的间质细胞形态，同样检测到E-cad表达降低，而间质标志物——α-SMA表达增高。通过对小气道上皮细胞紧密连接的基因芯片的研究发现，在肺功能正常的吸烟者和COPD患者气道内均存在E-cad向N-cad转化，而这种钙黏蛋白的转换不仅早于临床症状的出现，也是发生EMT的重要标志[11]。此外，在COPD患者肺内也观察到内皮细胞-间充质细胞转化，提示气道纤维化可能存在多重间质细胞来源[12]。

总之，在吸烟者特别是吸烟的COPD患者气道内存在明显EMT的激活，EMT是COPD小气道增厚和纤维化的重要因素。肺功能正常的吸烟者气道内EMT的出现，提示EMT可能是香烟烟雾诱导的气道早期病理改变[13]。

3 EMT在COPD气道中的作用机制

气道上皮细胞受生长因子、炎性细胞因子、缺氧等不同信号分子刺激后相关信号通路被激活，激活下游各级转录因子参与EMT过程，影响其增殖、迁移及分泌等生物学行为。

3.1 转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路

TGF-β是一种多功能多肽类细胞因子，在器官发育、组织修复、炎症、细胞增殖及分化等方面均发挥着重要作用。TGF-β尤其是TGF-β1被认为是促使多种上皮组织发生EMT的“开关因子”。多项研究发现，COPD患者血清、支气管肺泡灌洗液及肺组织中TGF-β1表达均明显增高[14-16]。TGF-β1首先与TGF-β受体2(TGF-β receptor 2，TGF-βR2)结合并发生构象变化，并被TGF-βR1识别结合形成三聚体，三聚体中TGF-βR1被TGF-βR2磷酸化，进一步活化细胞内下游信号传导分子——Smad2，磷酸化的Smad2(pSmad2)与Smad3形成同源寡聚体，再与Smad4结合形成异源寡聚体转入核内，与不同的DNA结合蛋白协同激活下游转录因子，如锌指E盒结合蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)1、ZEB2、Snail、Slug等，进而抑制E-cad、ZO-1等紧密连接蛋白表达，上调α-SMA等靶基因表达，促进EMT的发生[17]。体外TGF-β1刺激肺上皮细胞48 h后，原本呈鹅卵石排列的细胞呈现间质细胞形态，细胞间隙增加，E-cad表达明显下降，N-cad、α-SMA表达均增加，且与TGF-βR2、TGF-βR1、pSmad2、pSmad3上调呈正相关[18]。体外研究证实，应用TGF-βR1抑制剂——SB431542或利用小干扰RNA沉默Smad2可拮抗气道上皮细胞EMT过程，增加E-cad表达，降低α-SMA、N-cad、波形蛋白、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)表达[19-20]。表明抑制TGF-β/Smad通路有助于减轻EMT，改善COPD气道重塑的发展。除Smad信号通路外，TGF-β1还通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路，如细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK) 家族等促进EMT的发生[21]。YANG等[22]研究发现，TGF-β1体外刺激肺上皮细胞后ERK、p38磷酸化水平均明显增高，分别抑制ERK、p38后可调节下游E-cad，使其表达增加，并降低α-SMA、波形蛋白、纤维连接蛋白表达，抑制细胞迁移，减轻EMT。

3.2 Wnt/β-联蛋白(β-catenin)通路

Wnt是一种分泌性糖蛋白，与其膜受体——卷曲蛋白受体结合后作用于细胞内Dishevelled蛋白，抑制糖原合成酶激酶-3活性和细胞质中β-catenin的降解，使β-catenin在胞质内蓄积增加，进入细胞核内，与转录因子淋巴样增强子形成复合物，激活下游目的基因——c-myc、细胞周期蛋白D1等表达诱发EMT[23-24]。体外用尼古丁刺激人支气管上皮细胞24 h后检测到Wnt3a表达明显增高，且呈尼古丁剂量依赖改变，进而促使β-catenin核转位增加，激活下游基因，增加α-SMA、波形蛋白、MMP-9、Ⅰ型胶原蛋白表达，降低E-cad水平，进一步靶向阻断Wnt/β-catenin通路可，逆转尼古丁诱导的EMT[25]。

3.3 磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素蛋白(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/ mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)通路

PI3K具有异二聚体结构，活化的PI3K二聚体构象变化，磷酸化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)转化为磷脂酰肌醇4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3)，PIP3与细胞内信号蛋白——Akt、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)结合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308，活化的Akt进一步激活下游靶点——mTOR，调控下游靶基因表达，在细胞增殖、分化、凋亡、极性转化中发挥重要作用。有研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路不仅促进炎症细胞的激活，也参与了对COPD气道重塑的调节[26-27]。CHEN等[28]用脂多糖体外诱导支气管上皮细胞发生EMT，结果显示，p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显上调，继续以PI3K/Akt通路抑制剂——Ly294002干预可上调E-cad水平并降低波形蛋白、α-SMA、MMP-2、MMP-9、纤维连接蛋白表达，抑制EMT的发生。

3.4 多种微小RNA(micro RNA，miRNA)参与了EMT的调节

miRNA是一类由19～24个核苷酸组成的非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的3′非翻译区结合形成沉默复合体，抑制其翻译或促进其降解，从而达到调控相关蛋白表达的作用。近年来，大量研究表明，miRNA参与了气道EMT的反馈调节，如miR-29b在COPD患者体内表达下调，影响细胞周期；体外研究表明，miR-29b可通过作用于一些多功能转录因子调节肺上皮细胞增殖、迁移，并抑制其间质标志物表达[29-30]。miR-200b-3p通过下调锌指蛋白532、ZEB2表达，抑制TGF-β1诱导的支气管上皮细胞EMT的发生[31]。有研究发现，COPD小鼠肺组织miR-515-5p表达明显降低；进一步体外试验证实，外源性增加miR-515-5p可降低香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞间质标志物的表达，并上调E-cad水平，这一过程与miR-515-5p直接负反馈调节转录因子叉头框蛋白C1/Snail有关[32]。miRNA种类多，作用机制纷繁复杂，一种miRNA可通过多重机制调控机体功能，一种病理过程也可能受到多种miRNA的协同调控，COPD是多基因介导的疾病，未来需要更大样本的临床随机对照试验和更深入的基础研究验证。

4 小结与展望

香烟烟雾无疑是导致吸烟者肺内EMT的重要“驱动力”，但戒烟本身并不能逆转气道中已出现的EMT，即使失去了最初的诱导刺激，EMT依然可通过一种自我延续的方式继续进展[33-35]。EMT的终止受哪些因素控制、何种因子启动了非吸烟COPD人群的EMT过程、COPD中EMT的具体调控机制等仍有许多未解之谜，多个信号通路的交叉协同促进了EMT的发生和进展。对于COPD而言，关键在于早期预防，EMT为COPD的治疗开辟了新的领域，更深入、更系统的探究EMT在COPD气道重塑中的具体作用机制，寻找关键靶点，对COPD的精准预防与治疗具有十分重要的意义。