干细胞外泌体心肌保护作用的研究进展

李慧丽，周成斌

我国正在逐步进入老龄化社会，心血管疾病的发病逐年上升，其被认为是世界各地发病和死亡的主要原因之一。 近年来，随着生物技术的发展，应用干细胞治疗相关心脏疾病成为研究的热点，但是干细胞移植到心肌梗死区修复心肌组织存在争议。 外泌体是一种由多种细胞分泌的纳米级膜性囊泡，直径通常介于50 ～150 nm，于电镜下观察可见具有特征性的“蝶形”小体［1－2］，可以通过配体介导作用于特定的组织和细胞并根据其结合分子定位于特定的组织或微环境，将信息传递至靶细胞并调节其功能，有研究显示其具有心肌保护作用［3］。 本文意在阐述干细胞外泌体在心肌保护方面的应用进展。

1 来源

外泌体是细胞外囊泡的一种，最初细胞外囊泡被认为是无用的物质，后发现由网织红细胞通过胞外途径释放而被认识［4］。 这种胞外途径后来逐渐被证实可以发生在许多细胞中，如B 淋巴细胞、T 淋巴细胞和肥大细胞等免疫细胞可以通过分泌外泌体进行免疫应答。 陆续有研究发现，外泌体可以存在于树突状细胞的表面或某些生理液体［5］，如羊水或恶性胸腔积液中［6］。 鉴于造血细胞可以在体外分泌外泌体，有研究者对外泌体是否可以在血液中存在进行了研究，研究后证实血液可以作为外泌体获得靶标的自然环境［7］。 骨髓源性的外泌体并不少见，目前的研究主要是间充质干细胞、树突状细胞、基质细胞等［8－10］。 外泌体膜上富含丰富的物质，包括热休克蛋白家族（HSP60、HSP70 和 HSP90 等）主要参与外泌体运输、四跨膜蛋白家族（CD63、CD9 和CD81）以及一些细胞特异性的蛋白包括CD86（抗原提呈细胞来源）、MHC－Ⅱ（抗原提呈细胞来源）、乳凝集素（不成熟的树突状细胞）以及A33（结肠上皮细胞来源）。 其中最常见的细胞外囊泡包括CD63、CD81、CD9 以及 HSP70、TSG101、ALIX 等。

2 作用机制

2.1 外泌体与旁分泌 旁分泌机制是最早提出用于解释干细胞相关作用的机制，之前的研究认为干细胞发挥保护作用的方式是通过直接分化为心肌细胞，然而后期的研究发现小鼠心脏干细胞直接分化为心肌细胞的比例非常低，因此学者提出干细胞对心肌保护的作用机制可能是并非直接分化［11］。 Lai等［12］通过超速离心法对干细胞培养基进行研究，在电镜下对其观察并通过质谱分析等实验方法研究后提取出外泌体，并证实外泌体对于减少心肌梗死小鼠的受损心肌面积至关重要。 也有研究发现，将干细胞培养基中的外泌体去除后，培养基的上述作用明显减弱，对心肌的保护作用也不明显［13］，这些研究都可以表明在干细胞对心肌损伤的保护方面，旁分泌产生外泌体在其中发挥着重要的作用。 外泌体已经成为干细胞旁分泌效应的典型代表，对于干细胞发挥作用、维持细胞间的信息传递以及生物学行为方面意义重大。

2.2 外泌体介导信息传递 细胞间相互作用方式有很多，包括释放核酸、蛋白质、脂质和其它分子，这些成分可以介导信号转导至细胞外受体，还包括通过囊泡发挥作用，将mRNA、蛋白质和miRNA 转移至受体细胞中。 而外泌体成为潜在候选物，其与靶细胞相互作用包括：①外泌体的跨膜蛋白可直接与靶细胞的信号受体相互作用；②外泌体内化到受体细胞内；③外泌体与受体细胞的质膜融合，并将其内容物输送到胞浆中；④外泌体中含有 miRNA 和RNA，可以进行遗传物质的传递。 多种物质会存在外泌体表面，这些物质大多数含有活性脂质成分，包括鞘氨醇－1－磷酸和神经酰胺－1－磷酸，若外泌体进入靶细胞，这些物质可发挥抑制细胞凋亡和刺激血管生成的作用［14］，同时，外泌体所含的miRNA 也随着被转移到受体细胞。 在这个过程中，不仅发挥了传递信息的作用还发挥调节细胞功能的作用。 间充质干细胞外泌体是一个典型代表，其中包含多种细胞因子（如白介素－6 和白介素－10）、生长因子（如转化生长因子－β 和干细胞生长因子）、信号脂质、mRNA（如胰岛素样生长因子）和调节 miRNA（如miR－21 和 miR－133b）［15－19］。 这些物质在广泛的生理过程中发挥主要和次要的调节作用，包括生物体发育、表观遗传调控、免疫调节和肿瘤发生及进展。

3 干细胞外泌体对心肌细胞的作用

自1968 年首次成功进行骨髓细胞移植以来，细胞治疗的再生医学已逐渐成为许多疾病的替代治疗策略，尤其是干细胞在心血管疾病治疗方面意义重大。 一些试验证明，基于干细胞的疗法可以替代丢失的心肌细胞，随后改善收缩力，治疗心脏疾病［20］。但是对于干细胞疗法陆续有研究发现具有致瘤风险，而外泌体疗法未观察到致瘤性存在［21］。 所以外泌体是克服干细胞疗法相关缺陷的有效选择，可以将信息传递至靶细胞并调节其功能，进而对心脏发挥保护功能。

3.1 间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）外泌体 MSC 是一种能够分化为多种细胞类型的多能干细胞（multipotential stem cells，iPSCs），是一种非常有前途的、主要的细胞治疗剂，用于组织再生和修复。 作为MSCs 旁分泌的代表，外泌体在心肌再生医学领域广泛应用。 有趣的是，miRNA 在 MSC和MSC 衍生的外泌体之间的表达模式相似。 在急性心肌梗死大鼠模型中，两种治疗下都观察到了心脏修复作用，其证据是促进新生血管形成、减少细胞凋亡、抑制纤维化［22］，促进心肌细胞增殖。

3.1.1 促进新生血管形成 在大鼠心肌梗死模型中，静脉注射外泌体显著增加了心脏功能和血管生成。 有证据表明，miR－126 和血管内皮生长因子富集的MSC 来源的外泌体促进缺血组织中促血管生成mRNA 的表达，而治疗组miR－126 基因敲除的MSCs 外泌体的促血管生成作用减弱［23］。 Wang等［24］研究显示MSC 衍生的外泌体通过传递miR－210 促进小鼠心肌梗死模型的血管生成。 miR－210沉默的MSCs 外泌体促血管生成作用显著降低。 Ju等［25］建立小鼠心梗模型，通过设置对照实验，分别在心肌梗死边缘区注射MSC 分泌的外泌体和磷酸缓冲盐溶液，发现与对照组相比，接受MSC 外泌体治疗可以促进心脏血管生成和心肌细胞增殖。 以上研究可以证实MSC 外泌体可以对心肌梗死的治疗起到很好的作用，通过促进血管生成来改善梗死的症状，有利于梗死病变的恢复。 Huang 等［26］研究发现，外泌体可通过增加基质细胞衍生因子－1 的表达来发挥降低炎症反应的作用，并且可以提高MSC 的存活率。 这项研究对治疗方式进行了改进，具体实施是先将外泌体递送到心肌，然后再将MSC 移植到梗死部位，当和单独使用外泌体或MSC 治疗进行对比后发现，这种方式可显著改善心脏功能，对新血管形成以及减少梗死面积意义重大。

3.1.2 减少心肌细胞凋亡 在Yu 等的一项研究中构建小鼠心肌梗死模型，在这个模型中确定了GATA－4 过表达的MSC 来源的外泌体对心梗的影响。结果显示，对于体外低氧环境下培养的心肌细胞，这些外泌体显著提高了细胞存活率，保留了线粒体膜电位，在小鼠心肌梗死模型中恢复了心脏收缩功能，减少了梗死面积。 然后他们鉴定出在GATA－4 过表达的MSC 来源的外泌体中miR－19a 含量较高，通过抑制磷酸酶和磷酸酶同源物参与心脏保护作用［27］。 如上所述，这些研究揭示了骨髓 MSC 来源的外泌体对心肌细胞存活方面的关键作用，这可能是治疗心血管疾病的潜在干预措施。 然而，不同的MSC 类型分泌携带特定内容物的外泌体可发挥多样的功能效应。 研究发现，通过从股骨和胫骨的骨髓中分离MSC，对其外泌体进行提取后可以发现，外泌体 miR－143－3p 通过 CHK2－Beclin2 通路调节心肌缺血再灌注损伤的自噬作用有效减少细胞凋亡，在体内实验中也得到了相同的结论［28］。 Wang等［29］通过将缺血性心肌靶向肽基序 CSTSMLKAC装载到外泌体表面进行实验，这种靶向作用可以将外泌体精确递送到缺血性心肌细胞。 结果证实，载有缺血性心肌靶向肽的外泌体作用于缺血性心肌细胞的数量相比较空白外泌体明显增多； 并且这种方式可使心肌细胞凋亡减少、血管生成增加、心肌梗死面积缩小并改善心脏功能。

3.1.3 抑制心肌纤维化 有研究发现通过上调外泌体miR－133a 可以促进病毒性心肌炎大鼠的心肌细胞活力，抑制炎症、凋亡和纤维化，沉默miR－133a可有效逆转外泌体对病毒性心肌炎大鼠的作用。 而且进一步研究后发现，通过靶向MAML1（主导控制样蛋白1）提高病毒性心肌炎的心肌细胞的活力，抑制心肌细胞凋亡。 外泌体miR－133a 可以通过下调MAML1，抑制病毒性心肌炎大鼠的心肌纤维化，从而抑制心肌炎的进展［30］。 Xiao 等［31］的研究也表明过度表达的miR－133a 抑制血管生成、凋亡、纤维化和炎症，同时加速缺血性心肌疾病的治疗性心脏重塑。

3.2 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）外泌体ESCs 来源于一个胚胎未分化的内团细胞，可以自我更新并分化为多种类型的细胞，如心肌细胞等。同时，ESCs 分泌的外泌体将成为心血管疾病的替代治疗策略，其通过促进新生血管形成、发挥抗凋亡和抗纤维化以及诱导心肌细胞增殖的方式，在心肌损伤时具有治疗潜力。

3.2.1 促进血管新生 有研究发现ESC 来源的外泌体可以减少横向主动脉收缩引起的心力衰竭，其作用是通过FGF2（碱性成纤维生长因子）信号发挥改善心脏功能和促进心血管形成的作用［32］。 在梗死后小鼠心力衰竭模型中，Kervadec 等［33］发现梗死后给予人ESC 来源的心血管祖细胞（hESC－Pg）释放的外泌体与给予hESC－Pg 作用相似。 由超声心动图引导，经皮注射外泌体至梗死周围心肌。 结果表明，外泌体可改善心脏功能，在促进血管中再生方面具有重要作用，这是由促进细胞存活和增殖的旁分泌因子介导的。

3.2.2 减少细胞凋亡 阿霉素在治疗疾病时可以导致心脏毒性，具体表现为不可逆的扩张型心肌病，进而可以进展为充血性心力衰竭。 现有研究表明，心肌细胞凋亡是阿霉素诱导心肌毒性的主要原因［34］，但其分子机制尚不清楚。 Tavakoli 等［35］首次报告了阿霉素引起的心脏毒性反应介导的炎症和细胞死亡可以由ESCs 外泌体抑制，这可用作治疗阿霉素诱导的心脏毒性的未来治疗选择。 研究者还发现ESCs 外泌体 miRNA－21 通过下调 PDCD4（细胞程序性死亡4），对氧化应激诱导的H9C2 心肌细胞凋亡可以起到很好的保护作用。

3.2.3 抑制心肌纤维化 Khan 等［36］研究后发现来源于小鼠ESC 的外泌体可恢复心脏功能，通过减少心肌纤维化，改善心功能而发挥作用。 研究表明，与未处理的心血管祖细胞（iPSC－progenitor cell， iPSC－Pg）相比，miRNA－294－3p 处理导致 iPSC－Pg 在 S期积累，G1 期显著减少。 miRNA－294－3p 模拟处理的 iPSC－Pg 中细胞周期蛋白（E1、A2 和 D1）的 mRNA 表达增加，提示 miRNA－294－3p 增强 S 期转变。进一步研究证实这些生物学作用的产生可能与ESCs 外泌体将miR－294 递送到心肌细胞有关。

3.3 其他干细胞外泌体 之前的研究已经证明了诱导iPSC 外泌体具有影响心血管疾病实验动物模型的新生血管形成和心肌细胞存活的治疗效果。 由人类诱导iPSCs 衍生的iPSC－Pg 分泌的外泌体在治疗充血性心力衰竭方面是有效的，可能通过其特定的miRNA 发挥作用，这些miRNA 在进化上是保守的，与组织修复途径相关。 并且也有研究发现与iPSCs 移植相比，iPSCs 衍生的外泌体在左室功能、血管化、凋亡和肥大的改善方面表现出更好的心脏修复［37］。 外泌体介导的信息传递对靶细胞具有调控作用的潜力，特别是miRNA 的外泌体转移是组织再生过程中调控微环境的重要过程。 Wang 等［24］发现从小鼠心脏成纤维细胞来源的iPSCs 中鉴定出的外泌体含有心脏保护miRNA，其中包括Nanog 调节的miR－21 和缺氧诱导因子 1α 调节的 miR－210。 这些分泌的外泌体可以在体外保护心肌细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激，在体内保护心肌细胞免受心肌缺血再灌注损伤。 而且患者特异性iPSC／iPSC 来源的细胞可以消除受体的免疫抑制。 因此，这些外泌体可能得到进一步应用。

目前造血干细胞外泌体对心肌细胞发挥作用的研究相对较少，主要集中于血液系统疾病，由于其避免伦理和免疫排斥问题，在白血病的诊断和治疗方面具有作用。

4 问题和展望

目前多种干细胞外泌体对心肌的保护作用已经被证实，但是造血干细胞外泌体是否具有心肌保护作用未得到研究。 虽然外泌体具有特异性、靶向性和稳定性等特点，但是外泌体在体内输注并非十分理想，多种因素会干扰其发挥作用，导致干细胞外泌体输注体内时并没有完全靶向至病损处，部分干细胞外泌体存在“浪费”的情况。 而且在干细胞外泌体对心血管疾病治疗如此“火热”的今天，造血干细胞外泌体对心脏疾病的研究却很少。 Wan 等［29］采用两步外泌体递送策略，先向阿霉素诱导的心肌毒性模型输注网格蛋白重链抑制剂（如氯丙嗪），显著阻断脾脏和肝脏中单核吞噬细胞系统的内吞作用，再注入装载 miR－21 的外泌体，与未输注网格蛋白重链抑制剂组相比，装载miR－21 的外泌体对心肌的保护作用显著增强。 最近有研究发现［38］，在体外循环期间红细胞产生的外泌体会引起肾脏的损伤，他们通过抽取体外循环不同时间段内患者的血液进行检测，并提取外泌体进行动物实验验证得出了这个有趣的结论，所以这为外泌体作为医学治疗的研究热点提出了警示，对于干细胞外泌体是否在治疗疾病的过程中具有有害作用不得而知。 所以，探究造血干细胞外泌体对心肌的保护作用以及干细胞外泌体在发挥心肌保护时是否引起其他脏器的损伤仍值得继续研究。