间充质干细胞外泌体在口腔领域应用的研究进展*

刘紫微 时 权 王思拓 徐娟

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节特性的成体干细胞群。目前已从多种组织发现并分离出干细胞，如骨髓、脂肪、脐带以及口腔组织等[1]。不同组织来源的干细胞具有不同的生物学特性。牙源性干细胞是一类从口腔组织分离出的干细胞群体，主要包括牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)、根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)、脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs)、牙龈干细胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)以及牙槽骨骨髓干细胞(alveolar bone marrow mesenchymal stem cells，ABMSCs)等[2]。目前以干细胞为基础的组织工程技术在组织修复再生和疾病诊断及治疗中展现出良好的应用潜力。以往研究表明，干细胞通过定植分化为相应细胞在组织中发挥修复作用，但近期研究发现，干细胞发挥其组织修复功能与其旁分泌效应相关[3]。此外，干细胞治疗也存在免疫排斥、突变致瘤、伦理限制等诸多问题[4]。因此，作为干细胞旁分泌的主要物质，外泌体成为研究的热点。

外泌体是直径为30～150nm 的膜性囊泡，由磷脂双分子层结构及其内容物(DNA、miRNA、mRNA、蛋白质和脂质等)组成，于20 世纪80 年代在网织红细胞中被首次发现并被命名为“exosome”。外泌体起源于由胞内体内陷形成的多囊体，当多囊体与细胞膜融合后即被释放到细胞外，成为外泌体。此外，外泌体可由多种类型细胞(如上皮细胞、内皮细胞、间充质干细胞、淋巴细胞及树突状细胞等)在生理或病理状态下分泌产生并广泛存在于血液、尿液、唾液、母乳、脑脊液等体液中[5]。外泌体可以通过配体/ 受体结合、膜融合以及胞吞等方式将其携带的内容物转移至靶细胞，在细胞间通讯中发挥着重要作用，从而影响机体的生理病理过程，具有潜在的疾病诊断和治疗价值[6]。

干细胞具有促进组织修复与再生、抗炎及免疫调节等功能，被认为是外泌体分泌能力最强的细胞类型之一。干细胞来源外泌体(mesenchymal stem cells derived exosomes；MSCs-Exo)除具有与MSCs相似的生物学功能外，还具有低免疫原性等特性，能有效规避直接应用干细胞治疗的缺点，真正实现“无细胞治疗”。目前，MSCs-Exo 由于其良好的促组织再生、免疫调节以及靶向药物递送功能，在口腔领域展现出较好的应用前景。因此，本文将就MSCs-Exo 的生物学功能及其在口腔领域应用的研究现状作一综述。

1.MSCs-Exo 的生物学功能

1.1 促组织再生功能 MSCs 在组织再生过程中具有积极的促进作用，作为MSCs 的主要旁分泌物质，MSCs-Exo 具有与其母体细胞相似的生物学功能，能够增强受损组织的修复再生能力[7]。MSCs-Exo 已被证实可以促进多种组织的修复再生，如骨与软骨组织[8]、皮肤组织[9]、神经组织[10]等。

MSCs-Exo 在组织中发挥相应的功能可能与其携带的内容物相关。截止2019 年1 月，已从外泌体中发现并报道349988 种蛋白质、27646 种mRNA 和10520 种miRNAs[11]。MSCs-Exo 通过将其携带的内容物传递至相应的靶细胞，从而触发一系列的生物学反应并改变靶细胞的表型及功能，从而发挥组织修复作用。研究表明，MSCs-Exo 可以通过传递miRNAs 和IL-10、TGF-β 等蛋白质，调节炎性因子的分泌与表达，并能够增强细胞外基质的重塑能力，促进组织的修复再生[12]。同时，MSCs-Exo 对相关靶细胞生物学功能的调节作用也是其促组织再生的重要机制之一。大量体内外研究发现，MSCs-Exo 能够刺激相应靶细胞的增殖和趋化，增强靶细胞的生物学活性，从而增强组织的再生能力[13]。本课题组前期研究发现，GMSCs-Exo 能够通过影响皮肤成纤维细胞的增殖和活性而促进糖尿病大鼠皮肤创面的修复[9]。此外，由于血管化是组织修复重建的重要环节，因此促进受损组织的血管形成至关重要。MSCs-Exo 能够促进血管内皮细胞的增殖和活性以及新生血管的生成，从而为受损区域提供更多的营养和氧气，加快受损组织的修复与再生[8]。

1.2 免疫调节功能 机体的免疫反应是一项复杂的过程，其间不仅有炎性因子的释放，还包括免疫细胞的参与。MSCs-Exo 在抗炎过程中能够减轻机体的炎症反应并能够调节免疫细胞的生物学活性，具有良好的免疫调节能力。MSCs-Exo 的免疫调节功能与其携带的免疫调节因子密切相关。MSCs-Exo 通过向炎症区域释放抗炎相关因子，发挥抗炎功效。此外，MSC-Exo 还可以影响多种免疫细胞的功能，调节炎症过程。

MSCs-Exo 能够抑制外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)释放促炎因子，并能够通过影响MSCs 与PBMC 的相互作用而调节PBMC 的活性[14]。此外，MSCs-Exo 还可以调节淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及自然杀伤细胞的免疫调节功能。MSCs-Exo 能够诱导Th1 细胞分化为Th2 细胞，抑制Th1 细胞分化为Th17 细胞，促进Treg 细胞的增殖从而达到抑制自身免疫的目的。此外，MSCs-Exo 还具有抑制巨噬细胞活化的能力，并且能够刺激导促炎表型M1 向抗炎表型M2 的极化[15]。

1.3 靶向药物递送功能 作为一种新兴的药物递送载体，外泌体不仅具有无毒性、低免疫原性等生物学特性，还能够装载生物活性物质以及化学药物(如核酸、蛋白质、生物信号分子、天然及合成药物等)，在发挥自身功能的同时也实现了装载物的效能。Ma T等[16]通过转染技术将miR-132 装载到骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)来源外泌体，发现装载miR-132 的BMSCs-Exo 能够增强内皮细胞的体外成管能力并促进了小鼠心脏缺血区域的血管形成。Li H等[17]发现突变型HIF-1(缺氧诱导因子1)修饰的BMSCs-Exo 可通过增强机体的成骨和血管生成能力而改善早期类固醇激素引起的股骨头缺血性坏死症状。此外，Pascucci L等[18]发现装载紫杉醇的MSCs-Exo 能够有效抑制肿瘤细胞的体外增殖。以上可见，MSCs-Exo 自身既可作为“药物”使用，还能够充分发挥其装载物的生物学功能，具有较好的应用前景。

2.MSCs-Exo 在口腔领域的应用

2.1 颅颌面骨缺损再生 MSCs-Exo 在骨缺损与再生过程中具有良好的作用，已有多种MSCs-Exo 被报道能有效的促进颅颌面骨缺损的修复。Wu J等[19]将SHEDs-Exo 与β-磷酸三钙(β-TCP)支架结合后植入到大鼠牙槽骨缺损部位，发现与β-TCP 组和空白对照组相比，SHEDs-Exo/ β-TCP 组表现出了更好的新骨及新生血管形成能力。Yang S等[20]在大鼠颅中缝处制备直径8mm 的颅骨缺损模型并将负载人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)来源外泌体的水凝胶材料注射到颅骨缺损部位，8 周后发现含有hUCMSCs-Exo 的水凝胶材料组的骨修复效果最好。此外，Swanson等[21]发现DPSCs-Exo 与BMSCs-Exo 的体外促成骨能力相似，将DPSCs-Exo 负载于PLGA-PEG 共聚物微球材料能有效的促进大鼠颅骨缺损修复。

2.2 颞下颌关节炎的治疗 颞下颌关节炎(Temporomandibular joint osteoarthritis;TMJOA)是一种退行性疾病，通常包括颞下颌关节的软硬组织病变，以进行性软骨破坏、髁突重塑和滑膜炎为主要特征，患有TMJOA 的患者通常伴有关节疼痛和功能障碍，并伴有生活质量的下降[22]。由于髁突软骨的自愈能力有限，传统治疗对修复受损的软骨和周围组织的作用有限。MSCs-Exo 作为“无细胞治疗”，能早期抑制关节疼痛和退行退变，减轻炎症反应，促进关节软骨细胞基质基因表达，改善髁突及软骨下骨结构，促进关节的修复和再生[23]。Luo P等[24]发现过表达miR-100-5p 的SHEDs-Exo 可通过抑制促炎因子(IL-6、IL-8)和基质金属蛋白酶(MMP1、3、9、13)的表达，从而减轻TMJOA 的炎症反应。Zhang S等[25]通过建立大鼠软骨缺损模型并将MSCs-Exo 注射到关节腔内，观察到软骨和软骨下骨几乎完全恢复，其特征包括表面具有规则的透明软骨，与相邻软骨完全结合以及细胞外基质的沉积。目前关于外泌体修复关节软骨的机制尚不明确，部分研究表明外泌体介导的软骨修复过程与AKT，ERK 和AMPK 信号通路的腺苷活化有关[23]。

2.3 口腔癌的治疗 MSCs-Exo 能有效抑制口腔鳞状细胞癌的血管生成和肿瘤生长。李文文等[26]发现口腔白斑组织来源的MSCs 分泌的外泌体能够促进口腔癌前病变细胞的增殖和迁移能力，此为白斑癌变的早期诊断和治疗提供思路和方向。Rosenberger L等[27]将仓鼠颊囊癌作为人口腔鳞癌的临床前模型并向瘤内注射MSCs-Exo，结果表明瘤内注射外泌体具有显著的抗肿瘤作用，这与MSCs-Exo 抑制VEGF 的分泌和血管生成有关。在肿瘤微环境中，MSCs-Exo 通过将其运载物转移至癌细胞，能有效抑制肿瘤的进展[28]。此外，miRNAs 可以调控口腔癌的发展。Xie C等[29]发现过表达miR-101-3p 的BMSCs-Exo 通过调节COL10A1 可以抑制口腔癌细胞的增殖、侵袭和迁移。该研究进一步发现将过表达miR-101-3p的BMSCs-Exo 注射到裸鼠皮下可以有效抑制体内肿瘤的生长[30]。

2.4 牙髓组织再生 MSCs-Exo 可以通过增加特异性蛋白的表达、促进血管形成、增强牙髓细胞的活力等方式促进牙髓组织再生。Huang等[30]研究发现，DPSCs-Exo 可以通过激活P38 MAPK 通路而促进DPSCs 的牙源性分化，DPSCs-Exo 诱导后的DPSCs 牙源性分化标记基因及蛋白DMP1 和DPP 表达增高。同时，该研究将负载DPSCs-Exo的胶原膜材料嵌入牙根切片的根管间隙后植入到裸鼠背部皮下可以观察到新生的牙髓样组织。该研究还进一步发现牙源性条件下提取的外泌体的促牙源性分化能力更强。此外，DPSCs-Exo 还可以与细胞外基质蛋白(纤维连接蛋白和I 型胶原)结合，具有一定的临床转化能力[30]。

2.5 牙周组织再生 作为干细胞旁分泌的主要成分，MSCs-Exo 的出现为牙周组织再生提供了新的思路。Lei F等[31]通过建立大鼠牙周炎模型并使用负载PDLSCs-Exo 的基质胶或β-TCP 材料修复牙周炎区域的骨缺损，与单纯材料组相比，负载PDLSCs-Exo 的材料组的新生血管及新骨形成量更多。此外，PDLSCs-Exo 还可以通过抑制经典Wnt 通路的激活，促进炎症环境下提取的PDLSCs的成骨分化能力[31]。Chew JRJ等[32]研究发现，MSCs-Exo 可以通过激活CD73 介导的AKT 和ERK 信号通路而促进牙周膜细胞的增殖和迁移。该研究将负载MSCs-Exo 的胶原蛋白海绵填塞到大鼠牙周缺损部位并表现出了较强的促牙周再生能力[34]。MSCs-Exo 不仅可以作为“药物”直接用于牙周炎的治疗，还可以作为部分保守牙周治疗的辅助手段而提高牙周炎的治疗效果。有研究发现，向龈下刮治及根面平整处理后的大鼠牙周炎患牙的牙周袋内注射脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells;ADSCs)来源外泌体可以提高牙周炎的疗效[33]。

2.6 其他 MSCs-Exo 能够加速骨骼重塑，促进血管生成以及牙龈伤口的愈合，可以用来预防和治疗药物相关的颌骨坏死[34]。MSCs-Exo 还可以促进味蕾的再生和神经的支配，并有望在舌癌患者的术后舌重建中得以应用。Zhang Y等[35]研究发现，GMSCs-Exo 可以促进大鼠舌粘膜BDNF，Shh表达的升高，促进舌体损伤后味蕾及相关神经的再生，在舌体组织缺损修复中具有良好的应用前景。

3.MSCs-Exo 的展望与挑战

鉴于MSCs-Exo 在促组织再生、免疫调节以及靶向药物递送中的良好功能，其在口腔疾病治疗中的应用受到越来越多的关注。MSCs-Exo 不仅可以促进颅颌面骨缺损、牙髓组织以及牙周组织的修复再生，还可以用于口腔肿瘤、颌骨相关疾病、TMJOA 等疾病的治疗。

尽管MSCs-Exo 在口腔组织再生及相关疾病的诊断和治疗等方面展现出较好的应用前景，但其在口腔疾病治疗中的研究相对较少且具体机制尚不明确。同时，相比于牙源性干细胞来源外泌体，非牙源性干细胞来源外泌体在口腔领域的研究更少，且目前缺乏不同类型干细胞来源外泌体对于口腔疾病治疗的效果对比。此外，外泌体在具体应用中存在许多亟待解决的实际问题。如何提取高纯度高产量的外泌体是目前面临的难题，现存的提取方法都难以最大限度的同时提高外泌体的浓度和产量。另外，如何提高外泌体作用的靶向性及疗效也是具体应用中面临的挑战。目前MSCs-Exo 在口腔领域的研究还处于基础阶段，要真正实现临床转化还需要我们更多的发现和探索。