猪源沙门氏菌的分离与耐药性分析

2022-11-22傅水江沈青靓童旭栋沈坚金俊杰侯凤香

中国畜禽种业 2022年10期

傅水江沈青靓童旭栋沈坚金俊杰侯凤香

（1.浙江省绍兴市柯桥区畜牧兽医所，浙江绍兴 312030；2.浙江省台州市路桥区农业农村与水利局，浙江台州 318050；3.浙江省温州市农业科学研究院，浙江温州 325006）

细菌耐药性又称抗药性，指细菌对于抗菌药物作用的耐受性。由于长期、广泛和不合理、不规范使用抗菌药物，导致该细菌的耐药性日趋严重，甚至常出现多重耐药菌。猪沙门氏菌常引起猪场中断乳仔猪的败血症、肠炎腹泻等，是猪场普遍存在的常在菌，也是大部分猪场中耐药性较高，多重耐药较严重的常见菌。同时，沙门氏菌属的细菌大部分对人和动物均有致病性，是一种重要的人畜共患病，因不需要中间宿主，可在动物与动物、动物与人、人与人之间通过直接或间接接触传播，常导致人类食物中毒。美国、瑞士等国家都曾不同程度的暴发了沙门氏菌的感染。本菌若未得到有效的控制，将会给人类生命健康安全带来隐患。因此，开展沙门氏菌的分离鉴定及耐药性检测在医学、兽医学、公共卫生安全等方面都具有重要意义。本文通过采集柯桥区内的三个规模猪场的生猪肛拭子，进行沙门氏菌分离和耐药性调查，明确沙门氏菌的分离率及耐药情况，为更好地控制沙门氏菌的传播和耐药性的产生提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

庆大霉素、头孢唑啉、大观霉素、多西环素、丁胺卡那、恩诺沙星、林可霉素、氟苯尼考、卡那霉素、环丙沙星、复方新诺明、红霉素、链霉素等13种常用兽用抗生素纸片均购自杭州微生物试剂有限公司。四硫黄酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、XLD 琼脂平板，DNA Maker、Taq DNA聚合酶、dNTP 均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2 样品采集时间

2021 年9 月份从柯桥区苗仙生猪养殖场、柯桥区香逸生猪养殖场、柯桥区徐杏养殖场等3 个生猪养殖场内采集直肠内容物（用肛拭子插入肛门2～3cm，轻轻旋转）将拭子放入Cary-Blair 运送培养基中，0～4℃保存，送检（室温运送时间不超过2h，4℃保存不超过24h）。

1.3 分离鉴定

采集3 个规模猪场的195 头生猪采集195 份肛门拭子，按照《农业农村部关于印发<2019 年动物源性细菌耐药性监测计划>的通知》（农牧发〔2019〕 11号）进行菌株分离鉴定。先将拭子接种增菌液，培养18～24h，然后将菌液混匀，接种XLD 琼脂平板上，37℃培养约16～20h，在XLD 琼脂平板上的可疑菌落多呈粉红色透明（少数黄色透明）近圆盘状，边缘光滑或不光滑，菌落多有黑心，直径约为2～3mm。挑取可疑菌落，接种营养琼脂平板进行纯化，（36±1）℃培养16～24h。用接种环从营养琼脂上挑选16～24h 的纯培养物，置于0.5mL 灭菌生理盐水中，12000r/min 离心2min，弃上清。再加0.5mL 灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min 后，移至冰上，冷却后以12000r/min 离心2min，取上清液进行PCR 鉴定。

1.4 药敏试验

参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）制定的标准[1]，采用K-B 纸片扩散法，每个平板贴5 个药敏片，药敏片边缘距离不小于30mm，置37℃培养箱培养18h，测量抑菌圈半径，根据标准做出耐药性判定，即敏感、中介、耐药，并计算耐药率。

耐药率=耐药菌株数量/总菌株数量× 100%

2 结果与分析

2.1 药物敏感性结果

对柯桥区3 个规模猪场195 份猪直肠拭子样品进行沙门氏菌分离培养，经PCR 鉴定出46 株沙门氏菌，分离率为23.59%。药敏试验结果见表1。从表中可以看出，分离到的46 株沙门氏菌对13 种抗菌药物均表现出不同程度的耐药性。其中对林可霉素耐药率最高，达100%；对红霉素保持很高的耐药率为84.78%；对链霉素、复方新诺明、多西环素耐药率保持在41.30%～58.70%；对氟苯尼考、头孢唑林、卡那霉素、环丙沙星的耐药率在26.09%～34.78%；对丁胺卡那耐药率最低，耐药率为4.35%。

表1 猪源沙门氏菌分离株药敏试验结果

2.2 多重耐药性结果

多重耐药性结果见图1。从图中可以看出，在46株猪源沙门氏菌的分离株中，有0 株对所有13 种抗菌药物均敏感；3 株对10 种抗菌药物均耐药（10R）；4 株对9 种抗菌药物耐药（9R）；6 株对2 种抗菌药物耐药（2R）；1 株对1 种抗菌药物耐药（1R），在受试菌株中，对3 种及以上抗菌药物耐药的菌株占84.78%（39/46）。每株菌至少对1 种抗生素有耐药性，最高耐药重数达10R，尚未发现对13 种抗生素全部耐药的菌株。由此可见沙门氏菌多重耐药情况在3 个场中均存在，目前虽然尚未发现对13 种药物全部耐药的细菌，但已经出现10 种抗生素耐药的菌株，应当引起我们的极大关注。

图1 猪源沙门氏菌对13 种抗菌药物的多重耐药性分布

3 讨论

夏宇飞等从300 份猪源样本分离到37 株沙门氏菌，分离率为12.33%[2]。刘楠楠等采集江苏部分地区猪场200 份猪肛门拭子，分离到13 株沙门氏菌，分离率为6.50%[3]，均低于本试验中23.59%的细菌分离率，不同地区不同养殖场的沙门氏菌耐药性存在明显的差异，可能与各猪场的饲养管理、疫病防控技术水平等有关。

对46 株猪源沙门氏菌进行耐药试验，结果显示，猪源沙门氏菌都对林可霉素具有很强的耐药性，耐药率为100.00%，其次为红霉素，耐药率为84.78%。对丁胺卡那最为敏感，耐药率为4.35%。对3 种及以上抗菌药物耐药的菌株占84.78%（39/46)，呈现多重耐药性。王伟等从贵州省某规模化养猪场分离得到20株沙门氏菌，经药敏试验检测红霉素耐药率为90.00%，环丙沙星耐药率为20.00%与本文检测结果相接近[4]。方忠意等从河南部分地区生猪屠宰场分离得到的45 株沙门氏菌，药敏试验检测复方新诺明耐药率为40.00%，与本文检测结果相接近，恩诺沙星耐药率为62.22%，庆大霉素耐药率为57.78%，氟苯尼考耐药率为46.67%与本实验差异较大[5]；李月华等从6 个省分离得到89 株猪源沙门氏菌，药敏试验检测庆大霉素耐药率为43.82%，大观霉素耐药率为60.67%，四环素耐药率为86.52%，多西环素耐药率为85.39%，氟苯尼考耐药率为64.04%，与本文检测结果差异较大，多重耐药率为83.15%，与本文检测结果持平[6]。不同抗生素的耐药性以及不用地区耐药率的差异与猪场的发病情况、用药习惯、管理水平、技术力量等因素有关。从中我们可以看出，猪场必须提高饲养养殖管理、疫病防控水平，有条件的及时进行药敏试验，依据药敏试验检测结果，选用敏感药物进行合理用药、轮换用药、交叉用药；政府及监管部门应加强技术指导和抗生素的使用监管，减少或避免沙门氏菌耐药性的不断发展。