肉牛Myostatin 基因编辑育种研究

魏著英 白春玲 杨磊 苏广华 武云喜 张立 李光鹏

（内蒙古大学生命科学学院暨省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古呼和浩特 010020）

牛的自然寿命一般在15～20 年，妊娠期280d 左右，生长期需要2～4 年，在人工选择下培育一个肉牛新品种需要30～50 年。在我国，黄牛长期发挥役用功能，其肉用性能不足，主要表现为体型小、生长慢、产肉率低。国际知名的肉牛品种如安格斯牛、海福特牛、夏洛来牛、利木赞牛、皮埃蒙特牛及和牛等均为经几十年培育而成的优良肉用品种，广泛用于国际大规模集约化饲养，经济性能显著优于我国黄牛品种。为提升我国黄牛的肉用性能，本实验室历时15年，以蒙古牛、鲁西牛和西门塔尔牛为对象，通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术，对调控肌肉发育的抑肌基因（Myostatin，MSTN）进行编辑，成功培育出生长速度、屠宰率与净肉率显著提升的“双肌鲁西牛”、“双肌蒙古牛” 和“双肌西门塔尔牛” 新品系[1]。该文以鲁西牛为例，介绍MSTN 基因编辑牛培育过程。

1 MSTN 基因编辑位点的选择

MSTN 是TGFβ 超家族成员，是迄今为止发现的调控肌肉发育效率最高的单基因，主要参与骨骼肌细胞增殖与分化。突变后的MSTN 基因减弱了抑制肌纤维生长和增殖的功能，突变动物表现为肌肉发达的“双肌” 表型。

在MSTN 基因自然突变牛中，利木赞牛的MSTN突变位点在第一外显子282bp（C→A），德国黄牛在第一外显子191bp（T→C），夏洛莱牛发生于第二外显子238bp（C→T），阿奎坦牛在第二内含子1234bp处发生了T→G 的突变，皮尔蒙特牛的突变发生在第三外显子938bp（G→A），比利时蓝牛在第三外显子缺失了821～831bp 的11 个碱基[2]。突变对MSTN 基因的表达及蛋白活性造成显著影响，但不同突变位点的遗传效应有差异。第一或第二外显子主要编码MSTN 蛋白的信号肽和前肽，突变后对胎儿期的骨骼肌发育影响较小，难产率显著低于第三外显子突变牛。因此，我们以牛MSTN 第一外显子和第二外显子为目标区域，结合CRISPR/Cas9 基因编辑系统，最终选择第一外显子区的g.507del(6)和g.505del(115)位点、第二外显子的g.3942T>G 位点和g.415C>A 位点，以鲁西牛和蒙古牛为对象，分别对其MSTN 基因进行编辑改造，以使MSTN 基因突变效应发挥到适当水平，使所培育的编辑牛的生长速度与产肉率适中，避免引起器官变化与免疫变化，避免因难产造成的损失[2,3]。

2 原代MSTN 基因编辑牛培育

以鲁西牛为例，构建CRISPR/Cas9 基因编辑打靶载体，将打靶载体转染入胎儿成纤维细胞，筛选得到MSTN 第一外显子g.507del(6)或g.505del(115)位点缺失突变的基因编辑的阳性细胞；对基因编辑细胞进行DNA、mRNA 和蛋白质功能表达分析[3]；继而通过克隆技术生产MSTN 基因编辑胚胎120 枚，移植到62头受体中，9 头受体牛妊娠，产下8 头基因编辑雄性犊牛，其中6 头健康发育、体况良好，用于采精和系祖公牛[3-4]。

3 MSTN 基因编辑肉牛新品系培育

以原代基因编辑公牛作为系祖，通过人工输精与普通鲁西牛母牛配种，进行新品系培育。以1 号系祖双肌鲁西公牛精液对普通鲁西母牛进行配种，生产F1代；然后使用2 号系祖公牛的精液与F1代配种，获得F2代。挑选性状表型优秀的F2代公牛与F1或F2代母牛进行配种选育，最终获得基因型与表型稳定的双肌鲁西牛核心群。在选育过程中，动态监测各代次双肌牛的体重与体尺、血液生理生化等指标，开展育肥试验及屠宰试验等，收集育种数据并进行分析。

3.1 生长性状

除具备普通鲁西牛典型的“三粉” 特征外，双肌鲁西牛的前躯更加发达，后躯呈现典型的双肌表型，躯体呈宽大的矩形；耆甲部位发达。F2代双肌牛较F1代的肉牛特征更加显著。尤其是公牛，肩峰高而宽厚，胸深而宽，肌肉发达，躯体呈典型矩形（图1）。

图1 双肌鲁西公牛

体重是衡量生长的直接指标。24 月龄时，F1代双肌鲁西公牛的平均体重为510kg，F2代双肌公牛的平均体重为530kg，而普通鲁西公牛的体重为440kg 左右；F1代双肌鲁西母牛的体重为396kg，F2代双肌母牛的体重为402kg，而普通母牛的体重为366kg。可以看出，MSTN 基因编辑牛的增重效应显著，双肌鲁西牛的体重增速，体高、十字部高、体长、肩宽、髋宽、胸围等指标均优于同月龄对照鲁西牛[4]。

3.2 健康状况

通过持续监测双肌鲁西牛的血常规和血液生化指标发现，除淋巴细胞比率、中值细胞计数与普通鲁西牛存在差异外，其他指标如血小板计数、红细胞计数和血红蛋白等与对照牛之间无显著性差异。血清生理生化指标中高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂肪酶、葡萄糖、α-淀粉酶等糖、脂和蛋白质的代谢相关的指标都发生了变化，但是各项指标值均在正常生理范围内（未发表数据）。另外，为检测双肌鲁西牛的运动适应能力，让牛群跑起来模拟力竭运动，观察监测双肌牛的表现。结果不负众望，无论是空腹运动还是饱食后运动，双肌牛均并未出现猝死、晕厥、呕吐等不良症状，各项血液指标均正常[5]。另外，我们还发现双肌牛的抗氧化能力显著提升，这也是其健康的又一力证[6-7]。以上实验均说明双肌鲁西牛拥有良好的健康体况，而且其生理代谢机能与普通牛略有不同，更适应其肌肉发达的表型[5-7]。

3.3 产肉与肉质性能

为检验双肌鲁西牛的肉用性能，我们进行了育肥与屠宰试验。从屠宰数据可以看出，从18 月龄育肥至24 月龄后，双肌牛体重可达到662kg，胴体重402kg，屠宰率为60.8%，净肉率达到40.6%；对照牛平均活体重为615kg，胴体重350kg，屠宰率为55.7%，净肉率为37.6%，差异显著。同时检测了眼肉、米龙、上脑、腱子、里脊、外脊等部位的肉品质，各部位肌肉的pH、嫩度、系水力、含水量、脂肪酸、氨基酸和微量元素等均与对照鲁西牛肉无统计学差异。说明MSTN 基因突变牛的生长与产肉性能较普通牛显著提高，肉品质并没有下降[3]。

3.4 MSTN 基因突变促进肌肉发育的机制分析

上述数据表明，MSTN 基因突变后，黄牛的各项生长指标、肌肉发育、产肉性能等均大幅高于普通黄牛。为此，我们开展了一系列机制性研究，解析MSTN 基因编辑牛性状改善的生理学分子机制[6-11]。MSTN 基因突变，影响细胞外基质蛋白表达，通过与细胞外基质相关蛋白I 型胶原α1（Collagen Type I Alpha 1，COL1A1)基因相互作用，调控黏合斑、PI3K-AKT 和核糖体途径，促进肌肉发育和生长[9]；MSTN 突变通过Smad2/Smad3 激活去甲基化酶TET1，促进成肌因子去甲基化，提高肌纤维融合[8]；MSTN 突变激活了心肌细胞PDE5A-cGMP-PKG 途径，增强PFK 磷酸化，促进心肌糖酵解反应，提高牛心肌代谢[10]；MSTN 基因突变诱使牛胃肠道平滑肌发育，促进肠道蠕动，并改变胃肠道菌群组成[12-13]；MSTN突变引起肝脏初级胆汁酸生物合成增加和胆汁分泌途径信号显著上调，提高了脂代谢能力[11]；MSTN 突变显著提高了牛的抗氧化应激能力[6,7]。相关研究工作仍在持续深入。由此可知，MSTN 基因突变促进肌肉发育是机体全身性与整体性发生遗传效应的结果，我们将多角度、全方位的揭示MSTN 的作用机制，为育种提供翔实的理论支撑。

4 结语和展望

基因编辑牛的生长速度、体型外貌与产肉性能显著高于同品种普通黄牛，突破了黄牛品种体型小、生长慢、产肉率低的肉用性状瓶颈，初步系统揭示了基因编辑牛性状改善的生理学分子机制。近年来，在国家科技重大专项支持下，我国科学家利用CRSPR/Cas9 基因编辑系统创制了一大批具有实际育种潜力的基因编辑羊[14-24]、猪[25-34]和牛[4,35-36]，这些动物的表型均符合目标预期。可以说，我国在基因编辑猪、牛、羊育种研究方面已经位居世界前列。

随着自主基因编辑新技术的研发，我国在大动物生物育种方面必将迎来更大的进步。