外泌体在重要脏器缺血再灌注损伤中的治疗作用研究进展

曾可君 杨煜辉 胡喆

1.广东医科大学第一临床医学院，广东湛江 524000；2.广东医科大学附属医院麻醉科，广东湛江 524000

外泌体是一类独特的细胞外囊泡，是细胞分泌的纳米级膜颗粒，可以在血液中向全身传递信号，其内部的信息主要包括蛋白质和RNA 有效载荷，通过内陷形成包裹细胞质内容物，当这些多泡内泌体融合到细胞表面后，外泌体被释放到细胞外空间，并在细胞间传递信息，这种载物分子的传递能够调节受体细胞的功能，从而调节疾病的过程[1]。外泌体作为细胞间通讯的强大载体，一直是基础和临床研究的热点。除了研究最为广泛的间充质干细胞来源的外泌体，其在重要器官缺血再灌注损伤中的作用及其靶向修饰治疗显示出良好临床应用前景，本文将对其最新进展进行综述。

1 外泌体的生物发生与组成

1.1 外泌体的生物发生

细胞外囊泡是由所有细胞分泌的膜囊泡，包括凋亡小体、脱落微囊泡和外泌体[1]。外泌体是从多种细胞和组织中产生的纳米级（30～100 nm）膜性胞外小泡，其由细胞膜连续内陷包裹DNA、RNA、脂质、代谢物及胞浆和细胞表面蛋白等各类信号分子所形成[2-3]。外泌体在很长一段时间内一直被认为是细胞清理废弃物的“垃圾袋”[4]。随着研究的不断深入，人们发现外泌体能够介导细胞之间的通讯及物质传递，并在疾病的诊断、预后与治疗中发挥重要作用。

1.2 外泌体的组成

外泌体的释放及其介导的信号传递和交叉对话存在于多种病理生理状态下，因此，外泌体具有应用于特定疾病的诊断、预后和治疗的潜力。外泌体富含能够传递细胞间通信信息的生物活性基因组和非基因组生物分子，生物化学上，其具有其特征性蛋白，包括CD63、CD14、TSG101、热休克蛋白等[5]。除此之外，由于可被释放到细胞外空间，外泌体还可以通过旁分泌或自分泌的方式运输脂质、mRNA 和蛋白质等信号分子，结合不同的组织微环境及外泌体含量，可改变受体细胞的生物学行为，这种外泌体介导的反应既可促进也可抑制疾病[6]。除了治疗潜力外，外泌体还具有帮助疾病诊断的潜力。外泌体能够准确体现其“发生细胞”的来源及其生理病理状态，由于其存在于所有生物体液中，通过采集体液样本，可以很容易地获得其中内容物的组成，并进行多组分分析，可帮助癌症或其他疾病的诊断和预后判断。

2 外泌体的药物装载与靶向修饰

外泌体的治疗作用取决于封装在其中的药物成分及递送效率。首先一个关键挑战是如何有效地将药物打包成外泌体。一般来说，装载治疗药物的主要策略有3 种：①操纵母细胞中的基因表达，从而间接改变外显体或外显体模拟物中的蛋白质或RNA；②将治疗性成分导入母细胞中，以便将其释放到外泌体中；③直接向外泌体装载药物或分子。目前，具有应用前景的装载药物包括低分子化学药物，如纯化蛋白、短肽及核酸等[7]，超声处理、电穿孔、转染、孵育、挤出、皂苷辅助装载、转基因、冻融循环、热冲击、pH 梯度法和低渗透析等方法被用于将这些药物装载到外泌体中[8]。

与此同时，传统基因运送载体（如质粒、病毒）具有载体毒性、运送效率低、炎症反应等诸多缺陷，而天然的外泌体载体保留了其尺寸小、无毒、亲细胞等特性，与生物体具有高度的生物相容性，更适合作为药物运送载体。然而，天然外泌体进入体内后优先分布于肝、肾、脾等器官，很快被清除[9]。因细胞膜的空间走向与外泌体质膜极为相似，若利用目的细胞膜上的特异跨膜蛋白，如心肌归巢肽，将其修饰于外泌体膜表面，可使外泌体获得靶向性，提高治疗效果。Kanki等[10]利用噬菌体展示技术筛选出一个组分为9 个氨基酸的归巢肽，其可特异性地靶向到缺血后恢复灌流的心肌细胞中。但是，修饰于外泌体表面的归巢肽有被蛋白酶降解而失去其靶向性的自身缺点。最近的改良方法是在归巢肽的N 端融合1 个由5 个氨基酸残基组成的糖基化序列，保护归巢肽不被降解，同时增强归巢肽在胞内及外泌体上的表达，从而提高其靶向运送的能力[11]。近年来，外泌体的装载多样化与不同器官靶向修饰不断有突破，未来有一定的临床应用前景。

3 外泌体应用于缺血再灌注损伤治疗的研究进展

缺血和再灌注引起的组织损伤会导致多种疾病的发生与发展，包括心肌梗死、缺血性脑卒中、急性肾损伤、外伤、循环停止、睡眠呼吸暂停综合征。缺血再灌注损伤也是器官移植，心胸、血管及普通外科手术的主要挑战。缺血器官内代谢供需失衡导致严重的组织缺氧和微血管功能障碍。随后的再灌注进一步增强了先天性和适应性免疫反应及细胞程序死亡的激活[12]。近年来发现，外泌体治疗应对心、脑、肾等重要器官缺血和再灌注损伤有很好的效果。

3.1 外泌体与心肌缺血再灌注损伤

急性心肌梗死是世界范围内心血管疾病死亡的主要原因。及时再灌注一直被认为是治疗缺血性心脏病最有效的方法。然而，再灌注本身可能导致心肌损伤的加重。随着药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术等再灌注疗法的广泛应用，找到预防缺血再灌注损伤的有效手段已成为当务之急。

源自干细胞的外泌体已被证明具有促进血管生成和组织修复的强大能力。然而，天然外泌体的短半衰期和清除速率过快导致病变区域的治疗剂量不足。有研究发现，一种导电水凝胶可结合源自人脐带间充质干细胞的外泌体，将此结合物注射到大鼠缺血再灌注损伤心脏后，水凝胶有效延长了外泌体在缺血心肌中的滞留时间，心脏功能得到了显著改善[13]。另有研究发现，用单核细胞模拟物修饰间充质干细胞来源的外泌体，可利用单核细胞的募集特征，提高对受损心肌的靶向效率，在血管生成过程中促进内皮成熟并在缺血再灌注损伤后调节巨噬细胞亚群[14]。而用FNDC5预处理的骨髓间充质干细胞可以分泌更多的外泌体，且其处理所得外泌体在体内抗炎、抗凋亡、极化M2巨噬细胞等方面具有更好的治疗效果[15]。然而，间充质干细胞经常从老年或患病患者身上采集，且分离的外泌体通常含有较多杂质。Takov等[16]研究发现，人胎儿羊水干细胞来源的外泌体的心脏保护和促血管生成活性优于间充质干细胞来源的外泌体，在灌注前注射高纯度的人胎儿羊水干细胞来源的外泌体可使大鼠梗死面积减少（38±9）%。同时该研究结果还显示，在体外模拟缺血再灌注损伤模型中，人胎儿羊水干细胞来源的外泌体对分离的原代心肌细胞无保护作用，表明其具有间接的心脏保护作用。脂肪细胞分泌的外泌体同样可减轻小鼠心脏缺血/再灌注损伤。研究发现，能量紧张状态的脂肪细胞能够释放含有氧化受损线粒体的外泌体，其在心脏组织中诱导短暂的线粒体氧化应激，导致心脏产生补偿性抗氧化信号以保护心肌细胞免受急性氧化应激，从而减轻心脏缺血再灌注损伤[17]。这项研究表明，外泌体能够介导组织之间的功能性线粒体转移，这些脂肪细胞外泌体可能提供了有效的心脏保护生理途径以对抗缺血应激。除细胞器外，外泌体中的非编码RNA 也是重要的递送分子。研究认为，来自间充质干细胞的外泌体中的miR-25-3p通过靶向促凋亡蛋白和EZH2 减轻了缺血再灌注损伤[18]。在小鼠原代主动脉内皮细胞来源的外泌体上发现高表达的LINC00174，其介导外泌体抑制心肌细胞的凋亡、空泡形成和自噬，改善了缺血再灌注导致的心肌损伤[19]。外泌体对心肌保护或损伤的分子机制并未完全阐明，仍需结合多组学研究以进行更深入的探讨。

3.2 外泌体与脑缺血再灌注损伤

缺血性卒中是由于大脑动脉狭窄导致流向大脑的血液减少所致，溶栓剂已被用于临床诱导闭塞的脑动脉再灌注。然而，脑损伤在再灌注后可继续发展为缺血再灌注损伤。大鼠大脑中动脉闭塞模型已被广泛应用于研究脑缺血再灌注损伤。由于未修饰的外泌体靶向性较差，将其静脉注射到缺血脑区中仍然是一个挑战，近期研究发现，利用连接晚期糖基化终末产物受体结合肽的外泌体可作为低氧特异性的载体，用于抗miR-181a 寡核苷酸（AMO181a）的鼻脑给药，比未修饰的外泌体更有效地将AMO181a 运送到小鼠脑神经瘤细胞，下调异常增高的miR-181a 表达，上调Bcl-2 的表达，显著抑制梗死面积[20]。另有研究发现，在该模型下生长相关蛋白-43 表达增加，负载槲皮素的单克隆抗体生长相关蛋白-43 偶联外泌体可以通过外源性生长相关蛋白-43 与受损神经元表达的生长相关蛋白-43 相互作用而特异性地靶向作用于受损神经元，比单纯负载槲皮素的外泌体治疗的大鼠脑梗死体积更小，神经功能恢复更明显[21]。Tian等[22]发现，由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-4C 肽与乳胶黏附素融合的重组融合蛋白可自动结合到外泌体膜上，通过大鼠尾静脉注射人神经祖细胞来源的天冬氨酸-乳胶黏附素融合外泌体能靶向作用于缺血脑区，并显示出较强的抗炎作用。然而在临床患者当中，脑缺血或再灌注的损伤无可避免，因此，如何应对缺血后脑功能恢复也是目前重点研究方向。利用来源于干细胞的具有修复功能的外泌体是一种新的康复策略，如Dumbrava等[23]报道，间充质干细胞分泌的外泌体可促进老年大鼠大脑中动脉远端闭塞后的神经功能恢复和大脑重塑，有效地减少了年轻和老年大鼠的运动协调缺陷，促进幼年和老年大鼠脑梗死周围血管生成。星形胶质细胞则可以通过释放包含在细胞外囊泡中的细胞介质来加速中风后的基础恢复[24]，人羊水干细胞来源外泌体在脑缺血再灌注模型中能够激活促生存和抗凋亡途径，发挥神经保护作用[25]。

3.3 外泌体与肾缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤是急性肾损伤的主要原因。近年来对缺血再灌注所致急性肾损伤的病理生理学研究表明，免疫反应对肾脏缺血再灌注损伤和修复有重要影响。最近研究指出，小鼠静脉注射负载核因子κB 抑制剂的外泌体后，可降低其缺血后肾脏的核因子κB活性，并显著降低肾缺血再灌注术后的血清尿素氮、肌酐和中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白水平，减少细胞凋亡，与单纯抑制组比较，负载核因子κB 抑制剂的外泌体治疗还显著影响了缺血后肾脏免疫细胞的数量，降低了中性粒细胞、单核/巨噬细胞和T 细胞的比例[26]。干细胞来源的外泌体同样是肾缺血再灌注损伤的前沿防治方式。研究发现，人尿源性干细胞可通过其外泌体中miR-146a-5p 靶向核因子κB 信号[27]。在大鼠肾缺血再灌注模型中，尿源性干细胞可以通过外体miR-146a-5p 靶向白细胞介素-1 受体相关激酶1 的3’端非编码区，抑制核因子κB p65 的核转位和炎症细胞的浸润，从而保护肾功能。Cao等[28]发现，间充质干细胞来源外泌体能有效地向缺血肾归巢，并主要聚集在近曲小管，其中高度富集的miR-125b-5p 可通过抑制肾小管上皮细胞中p53 蛋白的表达靶向肾小管上皮细胞的周期阻滞和凋亡，改善急性缺血性肾损伤，促进肾小管修复。外泌体在肾缺血性损伤后血管愈合中同样发挥重要作用，研究发现，间充质干细胞来源的外泌体可促进大鼠肾缺血再灌注损伤后的血管愈合，外泌体涂层支架在植入28 d 后可加速再内皮化，减少支架内再狭窄[29]。

4 总结与展望

综上，临床对于延长外泌体的循环时间、提高靶向性及优化外泌体来源细胞都有了新的研究进展。由于外泌体是细胞天然来源而产生的，与脂质体比较，能更有效地进入靶细胞，并且在循环中的保留率更高，从而延长了治疗性物质在体内的循环时间。研究表明[30]，外切体上的CD47 会产生一个“自我保护”的信号，保护其不被吞噬，并限制其从循环中清除。这些稳定且循环时间长的内源性纳米载体为药物运输提供了保护，使其免于降解，并增加了药物向靶组织的传递。工程外泌体上富集的配体可用于诱导或抑制受体细胞中的某些信号传导，或将外泌体靶向特定的细胞类型，实现更精准地治疗。与此同时，外泌体RNA 可以被血源性核糖核酸酶保护而不被降解，再加上其与脂质体比较，系统保留性更好，这可以使外泌体在较远的位点发挥功能。除了用于治疗心、脑、肾缺血再灌注损伤，外泌体在脊髓[31]、肝脏[32]、肺[33]、肠道[34]缺血再灌注损伤的治疗中同样发挥一定的作用，但目前相关报道仍较少，仍需要进一步分析探索其详细作用机制。除此之外，目前还没有标准化的外泌体分离纯化技术及包装技术，且包装后的外泌体能否被机体耐受、广泛用于临床治疗，仍需反复研究。